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超氧化物歧化酶广泛存在于各种生物体内。目前已从细菌、藻类、霉菌、高等植物、昆虫、鱼类、鸟类和哺乳动物等各种生物体内分离得到,并通过多种方法应用到实际中,如化妆品、医药、食品、人及动植物许多疾病的检测方面。但是大多是从动物体内提取,因动物体内SOD含量多,活性高;而植物体内相对含量少,活性低。许多报道芦荟具有消炎、杀毒等多方面的功效,芦荟已作为药材、化妆品,保健食品在市场销售。可是至目前为止未见到从芦荟中分离纯化SOD的报道。基于以上三方面的原因,本文探讨了从芦荟中分离纯化SOD的方法并对其基本性质进行了研究。一方面为了更彻底地了解芦荟中的成分;另一方面为芦荟中的SOD的应用、基因克隆奠定基础。现将研究结果报告如下: 1.分离纯化 将芦荟的叶子洗净、擦干,加入Tris-HCl缓冲液进行组织捣碎提取SOD,高速离心;将提取液用丙酮使SOD沉淀、静止,低速离心;将沉淀用蒸馏水充分溶解,50℃水浴中加热15min,离心除去部分杂蛋白,获得粗酶液。将粗酶液过DEAE-琼脂糖柱层析,得三个活力峰,分别收集、透析、干燥浓缩后;再上Sephacryl S-200凝胶柱层析,按与DEAE-琼脂糖柱层析后同样的方法收集处理。将第二次得到的干燥的SOD进行同工酶电泳及活性染色、等电点聚焦电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。可知SOD-Ⅰ,SOD-Ⅱ,SOD-Ⅲ三种同工酶均得到完全分离纯化。SOD-Ⅰ纯化倍数为60.1,活性回收率为3.4%;SOD-Ⅱ纯化倍数为153,活性回收率为5.6%;SOD-Ⅲ纯化倍数为84.6,活性回收率为4.2%。由此可知利用此法SOD-Ⅱ纯化倍数及活性回收率在三个同工酶中最高。 2.性质研究 Cu,Zn-SOD对氰化物和过氧化氢均敏感。Mn-SOD对氰化物和过氧化氢均不 芦苔超氧化物歧化酶的分离纯化与性质研究敏感。而FnSOD对氰化物不敏感,对过氧化氢敏感。1。1几**N对芦苔中s0D活力几乎无影响;srnmol/L HZO。使芦苔中SOD活力完全失活。可以判定该酶是铁超氧化物歧化酶 凝胶过滤法测得SOD-I的分子量约为46 000 D,SOD-11的分子量约为35000 D子量为,SOD-Ill分子量约为 40 000 D。把通过凝胶过滤的 SOD-I、SOD-11、SOD-Ill酶,进行 SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测得芦苔中 SOD的亚基分子量分别为:SOD-I约为23000D、SOD《约为17000D、SOD-Ill约为19000D。这两种结果进一步证明芦苔中的三条 SOD同工酶均为 Fe-SOD;并且均由两个相同的亚基组成。 等电点聚焦电泳进一步证实芦苔中的三条同工酶完全分离纯化,并测得它们的等电点分别为:8.9、7石、7.35。 修饰齐uPMSF,DTT,PCMB,NBS,BrAc,IAc,SUAN,TNBS不适合检狈uSOD酶的功能基团。