背景与目的:近年来虽然胃癌的发病率和死亡率总体有所下降,但仍是包括中国在内东亚地区的高发恶性肿瘤。最新统计学数据表明,胃癌居我国肿瘤发病率与死亡率第二位。目前大多数胃癌患者确诊时已处于晚期,治疗方法有限、预后较差。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病因,与弥漫型及肠型胃癌的发生也密切相关。早在1994年WHO将H.pylori列为I类致癌因子。多研究表明,根除H.pylori可明显降低胃癌的发生风险。关于H.pylori感染致胃黏膜癌变的机制研究对于胃癌的早期筛查及预防策略制定具有十分重要的意义。目前全球范围内近50%人群感染H.pylori,仅少数人发展成胃癌。究其原因,除宿主与环境因素外,H.pylori细菌毒力差异是导致其感染后不同临床结局的关键因素。Cag A是H.pylori最关键的毒力因子之一,其通过T4SS系统进入宿主细胞后可通过多种调控多种信号通路导致细胞过度增殖、凋亡受抑制、迁移能力增强等多种生物行为学异常,最终促进胃黏膜癌变过程。循证医学证据表明,Cag A阳性的H.pylori菌株可明显增加胃癌发生的风险。Cag A转基因小鼠最终也会发生胃上皮内瘤变,促进上皮细胞表型转化为间充质表型,称之为上皮间充质转化(Epithelial-Meschymal transion,EMT),使细胞失去极性、获得迁移能力等。但是H.pylori Cag A调控EMT的具体机制仍不明确。Hippo/YAP信号通路通过调控细胞增殖与凋亡平衡,在控制器官发育、维持器官大小等发面发挥着重要作用。近年来研究表明,YAP作为该信号通路中关键的效应分子,其异常激活与多种肿瘤的发生发展密切相关。Hippo信号的异常可上调YAP的表达,促进YAP从细胞质转入细胞核中,诱导下游功能基因过表达,进而驱动细胞的过度增殖、存活及转移等。有研究显示,H.pylori感染与烷化剂MNNG联合作用后可引起小鼠胃黏膜YAP及其下游靶基因m RNA水平上调。但是H.pylori单一感染是否会引起Hippo/YAP信号异常进而激活原癌蛋白YAP,以及毒力蛋白Cag A在H.pylori调控Hippo/YAP信号通路中具体扮演何种角色,以上均需进一步探讨。Hippo/YAP信号通路在调控EMT这一重要肿瘤恶性转化标志过程中起着非常重要的作用。Hippo/YAP信号通路异常引起YAP过表达进入细胞核后可诱导EMT的发生。EMT是胃黏膜恶性转化的标志之一,发生后上皮细胞失去极性与粘附,转化成迁移能力较强的间充质细胞样特征。Cag A+H.pylori感染胃黏膜上皮细胞后也可诱导EMT的发生。目前,Hippo/YAP信号在Cag A+H.pylori诱导EMT发生过程的作用尚不清楚。因此,在本课题中,我们旨在探讨Hippo/YAP信号通路在H.pylori感染致胃黏膜病变过程中的作用;阐明Cag A在H.pylori感染调控Hippo/YAP信号中所扮演的角色;进一步研究Hippo/YAP信号转导在H.pylori感染诱导EMT过程中的作用及临床意义。材料与方法:(一)探讨H.pylori感染对胃黏膜上皮细胞Hippo/YAP信号通路的影响1.收集不同病理分期的胃癌(含癌旁组织),通过免疫组化检测Hippo/YAP信号中关键分子YAP及其同源物TAZ的表达,并分析其表达与临床病理参数的关系;2.将Cag A+H.pylori菌株7.13、PMSS1与Cag A-H.pylori菌株SS1与胃癌AGS细胞共培养,Western blot检测Hippo/YAP信号关键蛋白的表达,q RT-PCR检测信号下游靶基因CTGF、CYR61的表达;(二)幽门螺杆菌cag A基因敲除PMSS1△cag A突变菌株的构建与鉴定1.参考PMSS1 cag A基因全长序列,设计两对引物(cag Aup F/cag AL-5’RXS、cag Adn R/cag AF-3’FXS),采用重叠PCR构建cag A up-dn扩增片段,使其包含cag A基因上下游片段。将cat基因盒插入该片段,最终得到cag A基因敲除的重组质粒;2.通过电转化和自然转化将cag A基因敲除的重组质粒转化至PMSS1野生型菌株,筛选单克隆培养得到cag A基因敲除突变菌株PMSS1△cag A;3.设计引物,琼脂糖凝胶电泳检测PMSS1△cag A菌株中cag A基因片段是否存在以及验证cat基因盒的插入方向;Western blot检测PMSS1△cag A菌株中Cag A是否被敲除。(三)毒力因子Cag A在幽门螺杆菌诱导YAP表达、核移位及转录活性中的作用机制研究1.将PMSS1野生型与△cag A菌株分别与胃癌AGS细胞共培养,Western blot检测Cag A的转运及磷酸化水平,观察细胞形态学变化;2.将从胃黏膜不同病变阶段(慢性胃炎、肠上皮化生、胃癌)分离的临床H.pylori菌株分别与AGS细胞共培养,Western blot检测Cag A的转运及磷酸化水平;3.将Cag A+H.pylori PMSS1、7.13野生型菌株与相应的cag A基因敲除突变菌株与胃癌AGS细胞共培养:(1)Western blot检测Hippo/YAP信号通路中关键分子YAP蛋白表达水平;(2)免疫荧光检测YAP的细胞内定位;(3)q RT-PCR检测Hippo/YAP信号关键效应分子YAP及其下游靶基因CTGF、CYR61 m RNA表达水平。(四)Hippo/YAP通路活化在H.pylori Cag A诱导上皮间充质转化过程中的作用1.将Cag A+H.pylori PMSS1、7.13野生型菌株与相应的cag A基因敲除突变菌株与胃癌AGS细胞共培养,免疫荧光实验检测EMT上皮细胞标志物Ecadherin的表达水平;2.外源性转入YAP c DNA至胃癌AGS细胞,Western blot检测EMT相关蛋白表达;3.使用YAP抑制剂Verteporfin预处理后将Cag A+H.pylori PMSS1、7.13菌株感染细胞,免疫荧光检测E-cadherin的表达水平,Western blot检测EMT相关蛋白表达,Transwell实验检测细胞侵袭能力;4.收集慢性非萎缩性胃炎(chronic non-atrophic gastritis,CNAG)、肠上皮化生(intestinal metaplasia,IM)、异型增生(dysplasia,Dys)和胃癌(gastric cancer,GC)组织,通过免疫组化检测各病变阶段YAP、E-cadherin的表达,并分析其与H.pylori感染的关系。结果:(一)探讨H.pylori感染对胃黏膜上皮细胞Hippo/YAP信号通路的影响1.我们通过检测胃癌组织中YAP及其同源物TAZ的表达,发现细胞质与细胞核均存在二者表达。胃癌组织YAP、TAZ表达水平显著高于癌旁组织,且随着肿瘤恶性程度增加,其细胞内定位从细胞质逐渐转入至细胞核。进一步分析其表达与临床病理参数之间关系发现,YAP、TAZ表达水平与患者年龄、性别及肿瘤位置及肿瘤大小无明显关系,与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移数密切相关。2.Cag A+H.pylori PMSS1、7.13菌株与胃癌AGS细胞共培养后,发现H.pylori感染早期可上调Hippo/YAP信号关键效应分子YAP及其下游靶基因CTGF、CYR61表达。而磷酸化YAP及其上游激酶LATS1磷酸化表达均上调。以上实验结果提示:Cag A+H.pylori感染早期可诱导胃黏膜上皮细胞Hippo/YAP信号通路活化,YAP激活,下游靶基因表达上升,该过程不依赖于经典的Hippo上游信号调控机制。(二)cag A基因敲除H.pylori PMSS1△cag A突变菌株的构建与鉴定1.通过重叠PCR法成功构建cag A基因敲除的重组质粒,由于cat基因盒(上、下游引物分别为54、55)插入方向随机,得到54、55两种cag A基因敲除重组质粒。以自然转化(N)、电转化(E)进入PMSS1菌株后筛选氯霉素抗性的克隆并扩增,最终得到四株PMSS1△cag A突变菌株,分别命名为54E、54N、55E、55N。2.琼脂糖凝胶电泳结果表明这四个突变菌株cag A均已被敲除,54E、54N菌株中cat基因盒以54→55方向插入,55E、55N菌株中cat基因盒以55→54方向插入。Western blot结果显示这四个突变菌株不表达Cag A蛋白。以上结果表明:PMSS1△cag A突变菌株构建成功。(三)毒力因子Cag A在幽门螺杆菌诱导YAP表达、核移位及转录活性中的作用机制研究1.PMSS1菌株Cag A敲除后无Cag A转运至胃癌AGS细胞中。Cag A+H.pylori菌株可诱导胃上皮细胞形态拉伸形成“蜂鸟状表型”,Cag A敲除后细胞形态无变化。SS1菌株由于缺乏功能性的T4SS1导致Cag A无法进入宿主细胞内,感染后细胞形态也无明显变化。2.来自于胃癌组织的H.pylori临床菌株进入胃上皮细胞中Cag A表达明显高于来自于慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生组织的H.pylori临床菌株,慢性萎缩性胃炎与肠上皮化生组无明显差异。3.Cag A+H.pylori PMSS1、7.13野生型菌株感染AGS细胞后可诱导Hippo/YAP信号中关键分子YAP的表达,促进其核转位,以及上调下游靶基因CTGF、CYR61的表达,而Cag A敲除后则显著抑制了H.pylori活化Hippo/YAP信号通路的能力。以上结果证实:Cag A在H.pylori感染异常调控Hippo/YAP信号过程中起着重要作用。(四)Hippo/YAP通路活化在H.pylori Cag A诱导上皮间充质转化过程中的作用1.Cag A+H.pylori感染AGS细胞后可抑制上皮细胞标志物E-cadherin的表达,Cag A敲除后即可恢复部分E-cadherin表达,表明H.pylori Cag A可诱导EMT发生;2.细胞过表达YAP后可下调E-cadherin的表达,上调间充质细胞标志物N-cadherin的表达,促进EMT的发生;3.Verteporfin抑制YAP活性后可恢复部分H.pylori感染导致的E-cadherin下调,抑制H.pylori感染诱导的N-cadherin、Slug上调;4.Verterporfin显著抑制Cag A+H.pyloti感染诱导的胃癌AGS细胞侵袭;5.随着胃黏膜病变程度加深(慢性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌),YAP表达逐渐上升,相反,E-cadherin表达逐渐降低,二者表达呈负相关。进一步分析各病变阶段H.pylori感染组与H.pylori未感染组间的差异,发现在慢性胃炎的患者中,H.pylori感染组YAP表达水平显著高于H.pylori未感染组,E-cadherin表达水平则呈现相反的趋势。以上研究结果提示,Hippo/YAP信号异常导致的促癌基因YAP激活在Cag A+H.pylori感染诱导EMT过程中发挥重要作用。且在胃黏膜癌变早期过程中H.pylori感染即可活化Hippo/YAP信号通路,激活YAP表达,降低EMT上皮细胞标志物E-cadherin表达。结论:1.H.pylori感染可引起Hippo/YAP信号转导异常,促进关键效应分子YAP激活并从细胞质转入至细胞核,诱导下游靶基因表达。细菌毒力蛋白Cag A在该过程中扮演着十分重要的角色。2.Cag A+H.pylori感染活化Hippo/YAP通路后诱导EMT发生,促进胃黏膜恶性转化。