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水稻（Oryza sativa L.）不仅是研究单子叶生物重要的模式植物,也是世界上重要的粮食作物之一。而水稻在种植过程中会受到环境中许多生物胁迫,特别是一些病虫害可以导致水稻严重减产、影响品质。同时,大量农药的使用严重污染了环境,提高了病虫的耐药性,造成了粮食安全的隐患。因而,水稻抗病机制的基础研究对阐释植物的抗性机理具有重大的理论意义,在水稻抗病育种中也具有巨大的应用价值。稻瘟病（Pyricularia oryzae）和白叶枯病（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）均是水稻的主要病害,严重时可导致水稻颗粒无收。因此,稻瘟病和白叶枯病抗病机制研究有助于阐释水稻的抗性机理和抗性育种。本研究利用EMS（ethyl methane sulfonate）诱变籼稻恢复系缙恢10号（J10）获得稳定遗传的叶片类病变突变体并进行了系列研究。通过遗传分析和图位克隆技术得到了目的基因,RPM1 like gene 1（OsRLR1）,进一步分析了该抗病基因的表达模式,解析了野生型和突变体OsRLR1的蛋白结构以及在水稻抗病机制中的功能,主要研究结果如下:1.OsRLR1基因的定位与克隆在自然种植条件下,突变体rlr1从苗期开始在叶片中出现类似病变的细胞死亡现象并伴随着叶片衰老黄化的表型,而病变和黄化表型受到光的诱导。在突变体中,抗病相关基因OsNPR1、OsWRKY45、PAL1、OsPR1a、OsPR10被激活,对稻瘟病和白叶枯病的抗性显著增强。遗传分析表明,突变体rlr1的表型受一对隐性核基因的控制。利用分子标记将目的基因OsRLR1定位在第10染色体66 kb的区间内。通过gDNA和cDNA的测序发现,只有基因LOCOs10g07978编码框的第953位碱基由A颠换为T,导致编码氨基酸由GLU变为了VAL。因而,初步将LOCOs10g07978作为候选的目的基因。2.OsRLR1基因功能互补分析为了验证LOCOs10g07978是否是目的基因,克隆了其在野生型中的编码框序列,并在突变体rlr1中过量表达,突变体rlr1细胞死亡、早衰以及植株农艺性状得到了恢复。同时,与突变体rlr1相比,转基因互补植株的抗病性也得到了削弱,接近野生型的水平。因此,LOCOs10g07978是目的基因OsRLR1。3.OsRLR1基因的蛋白结构分析OsRLR1编码一个CC-NBS-LRR（CNL）抗病蛋白,多重序列比对与系统进化树分析表明OsRLR1编码蛋白与其他CNL蛋白很好的聚类在一起,与拟南芥抗病蛋白AtRPM1和玉米ZmRPM1同源,并与水稻的一个稻瘟病抗性蛋白OsPid3高度一致。对OsRLR1蛋白序列分析表明突变位点位于NB结构域,临近一个相对保守的RNBS-B/Se模体。参照蛋白ZAR1的三维建模表明:在OsRLR1（E318V）中,突变导致了其三维空间结构与结合ATP时的活化状态极为相似,暗示突变可能会导致结合的ATP不能水解或影响ADP结合而持续处于活化状态。同时,OsRLR1蛋白在酵母中能够通过CC结构域形成聚合体。OsRLR1和OsRLR1（E318V）蛋白均定位于细胞核。OsRLR1是一个典型的CNL抗病蛋白。4.OsRLR1基因的表达分析在水稻生长发育的苗期、分蘖期和抽穗期,对各个组织定量分析表明:基因OsRLR1主要在叶片中表达。OsRLR1的启动子表达GUS基因染色表明:GUS蛋白主要在叶片维管束中表达。在突变体中,OsRLR1基因的表达水平与叶片过敏反应程度正相关。稻瘟病和白叶枯病接种后,OsRLR1基因的表达上调。因此,OsRLR1在叶片维管束中组成性表达,但也受阳光和病菌的诱导。5.OsRLR1基因的过表达功能分析在野生型J10中,利用Ubiquitin强启动子过量表达OsRLR1基因。与野生型相比,转基因纯合植株对稻瘟病菌和白叶枯病菌的抗病性显著增强,抗病相关基因OsNPR1、OsPR1a和OsPR10的表达量也上升,但其抗病性仍然没有达到突变体rlr1的水平。不过,过量表达OsRLR1植株中没有出现类似病变的表型,同时对株高、结实率等农艺性状也没有影响,因而该基因在育种上具有潜在的应用价值。6.OsRLR1的互作蛋白筛选与验证通过酵母双杂交（Y2H）系统,利用OsRLR1的CC端结构域,筛选到了OsRLR1的互作转录因子OsWRKY19。并利用OsRLR1和OsRLR1（E318V）的CC-NB、CC-NB-ARC和全长蛋白序列在酵母中对互作关系进行了验证,进一步利用双分子荧光互补实验（BiFC）对OsWRKY19与OsRLR1的相互作用在植物体内进行验证分析。在烟草叶片细胞中,OsRLR1和OsRLR1（E318V）均能与OsWRKY19在细胞核中发生相互作用而发出黄色荧光信号,并与核指示剂DAPI指示信号高度吻合。因此,OsRLR1和OsRLR1（E318V）均能与OsWRKY19在细胞核中发生蛋白质的相互作用。7.互作蛋白OsWRKY19的干涉分析在突变体rlr1中,利用干涉技术（RNAi）沉默基因OsWRKY19的表达,获得了纯合的T2代干涉植株,OsWRKY19的表达量在不同的转基因株系中均得到了不同程度的降低,与突变体rlr1相比,干涉植株黄化和过敏反应的类病变表型得到了很大程度的减轻,植株长势和相关农艺性状也得到了很大程度的恢复。干涉植株接种稻瘟病菌和白叶枯病菌后,OsNPR1、OsPR1a和OsPR10的表达量也得到了很大程度的降低,对稻瘟病和白叶枯病的抗病性减弱。因此推测OsWRKY19正向调控了OsRLR1介导的抗性反应。8.转录因子OsWRKY19的转录分析在水稻原生质体中瞬时表达融合蛋白OsWRKY19-GAL,并测量LUC的活性发现OsWRKY19具有转录激活活性。进一步瞬时共表达OsWRKY19和OsPR10的1000bp的启动子发现OsWRKY19能够激活OsPR10的表达。而在烟草中,瞬时共表达实验表明OsRLR1和OsRLR1（E318V）均对OsWRKY19的转录具有增强作用,且OsRLR1（E318V）的增强效果远高于OsRLR1。