论文部分内容阅读
本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 iE-DAP对口腔黏膜上皮细胞中NOD1信号通路表达的影响 研究目的: 口腔黏膜上皮是口腔抵御病原微生物入侵的第一道防线，NOD1信号通路在口腔黏膜上皮细胞的固有免疫中发挥着重要作用。信号通路中的重要蛋白包括NOD1、RIP2和p-NF-κB。肽聚糖PGN的片段iE-DAP是NOD1蛋白识别的关键分子。许多研究已经证实，在不同细胞中，iE-DAP均能激动NOD1的表达，从而引发下游蛋白和细胞因子表达的变化。本实验通过使用NOD1激动剂iE-DAP刺激口腔黏膜上皮细胞Leuk-1，检测NOD1信号通路的中关键蛋白的表达变化，同时检测激动剂对细胞表达及分泌下游细胞因子的影响。 研究方法: 体外培养Leuk-1细胞，使用不同浓度NOD1激动剂iE-DAP刺激细胞24h后，应用四唑盐比色法（MTT法）检测不同浓度iE-DAP对细胞活力的影响，免疫印迹法检测不同浓度的iE-DAP对NOD1蛋白表达的影响，以及iE-DAP作用下NOD1通路关键蛋白RIP2，p-NF-κB表达的变化;采用酶联免疫吸附法检测细胞培养液上清中细胞因子IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10，TNF-α，IFN-γ和人β防御素hBD-1，-2，-3的分泌情况，采用实时荧光定量核酸扩增检测系统检上述细胞因子的基因表达变化。 研究结果: 1.低浓度的iE-DAP处理24h对Leuk-1细胞的活力无明显影响，高浓度的iE-DAP（1000μg/mL）作用24h后NOD1细胞活力明显下降; 2.iE-DAP以浓度依赖的方式增强了NOD1的蛋白表达水平;50μg/mL的iE-DAP作用24h后，NOD1信号通路关键分子RIP2和p-NF-κB的表达水平均显著升高; 3.iE-DAP作用Leuk-1细胞24h后，IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和hBD-2的基因表达或分泌水平显著上升，提示iE-DAP可通过激活NOD1信号通路而调控了细胞固有免疫和防御能力。 研究结论: NOD1激动剂iE-DAP通过增强NOD1信号通路关键蛋白的表达，激活NOD1信号通路，调节下游细胞因子的表达和分泌，从而在口腔黏膜上皮细胞固有免疫的调控中发挥重要作用。 第二部分 iE-DAP对吸烟抑制口腔黏膜上皮细胞防御能力的调控作用 研究目的: 吸烟能够抑制口腔黏膜上皮的固有免疫，是造成许多口腔黏膜疾病的重要原因。前期研究表明，吸烟能够抑制口腔黏膜上皮细胞NOD1信号通路中关键蛋白的表达以及hBD-1和hBD-3的释放。提示吸烟可能通过抑制NOD1信号通路的表达造成口腔黏膜局部免疫的削弱。二肽iE-DAP是NOD1蛋白识别的关键分子。本实验探讨了NOD1激动剂iE-DAP在CSE引起的口腔黏膜上皮细胞局部防御能力抑制中所起的作用。 研究方法: 体外培养Leuk-1细胞，分别使用不同浓度的CSE刺激细胞后，采用MTT检测CSE浓度对细胞活力的影响，使用4％的CSE刺激细胞24h后再使用50μg/mL的NOD1激动剂iE-DAP作用24h，然后采用免疫印迹法检测Leuk-1细胞中NOD1信号通路关键蛋白的表达变化，采用酶联免疫吸附实验检测细胞培养上清中细胞因子IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10，TNF-α，IFN-γ和防御素hBD-1，-2，-3的释放情况，采用qRT-PCR检测上述细胞因子的基因表达变化。 研究结果: 1.低浓度的CSE作用24h对Leuk-1细胞活力无明显影响，而32％以上浓度的CSE作用24h后，细胞活力显著下降; 2.4％的CSE作用24h后，再使用50μg/mL的iE-DAP刺激细胞24h，能够逆转CSE对NOD1表达水平的抑制，减弱CSE对RIP2，p-NF-κB的表达影响; 3.4％的CSE作用24h后，再使用50μg/mL的iE-DAP刺激细胞24h，能够逆转CSE对Leuk-1细胞因子的基因表达及分泌水平的影响; 研究结论: 结果提示，NOD1激动剂iE-DAP可阻断CSE对口腔黏膜上皮细胞NOD1通路和固有免疫的抑制作用，逆转CSE对细胞因子的表达和分泌水平的影响，可能减弱CSE诱发的炎症反应，维持细胞稳态。