绵羊是典型的季节性发情动物,其发情的季节性特点一直是制约绵羊生产繁殖效率的瓶颈。目前,针对绵羊季节性发情调控机制的研究主要集中在光通路调控方面,现普遍认为绵羊的季节性发情主要受光通路的调控,并初步确定了其繁殖活动的光通路季节性发情调控模式图。但在实际生产中发现,除了日照、温度等因素影响绵羊的季节性发情外,高营养水平饲喂的哈萨克羊在非繁殖(乏情)季节也可以表现出发情的现象,研究这一营养水平的改变如何调控非繁殖季节绵羊发情活动,对提高绵羊生产繁殖效率具有重要的指导意义;为此本研究开展了营养诱导舍饲绵羊在非繁殖季节条件下,发情相关micro RNA筛选及其靶基因功能验证实验,具体内容如下:目的:在不同营养水平处理绵羊中,通过筛选差异表达的micro RNA,用生物信息学分析方法推测其靶基因,分析靶基因在光通路或其它通路的作用,建立营养调控发情的信号通路。方法:(1)构建不同营养水平哈萨克羊群,在乏情期对试验绵羊发情情况观察记录。(2)乏情季节,前后分别屠宰3只发情(EN)和乏情母羊(AN),分别采集下丘脑(H)、垂体(P)和卵巢(O),共构建6个mi RNA文库,并进行生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR检测部分mi RNA相对表达量,验证建库的可靠性。对差异表达中出现频率较高的mi R-200a/b/c进行组织表达谱分析。(3)细胞水平验证实验。?通过双荧光素酶报告基因系统,验证mi R-200b对靶基因GNAQ的真实干扰作用。?mi R-200b干扰载体转染下丘脑神经细胞,选择GNAQ下游基因ITPR,PRKCB,GNA1,CREB,MAP3K1,GPR54,KISS1及Gn RH进行实时荧光定量检测。?mi R-200b干扰载体转染卵巢颗粒细胞,选择GNAQ下游基因COMT,HSD3B1,CYP1A1和PKA基因进行表达量验证。结果:(1)高营养实验组发情率明显高于对照组。(2)?下丘脑(HEN vs HAN)两文库相比,有8个已知和140个未知mi RNA表达差异显著。?垂体(PEN vs PAN)两文库相比,有14个已知和104个未知mi RNA表达差异显著。?卵巢(OEN vs OAN)两文库比较发现,有9个已知和104个未知mi RNA表达差异显著。通过软件预测出靶基因并进行GO分析发现,以上文库涉及细胞过程、发育过程、生长过程、代谢过程、生物调节过程、细胞融合、催化活性、繁殖过程和酶调节活性过程等。对其调控通路进行KEGG分析,发现有MAPK信号通路(钟基因相关通路),Gn RH信号通路(发情激素相关),胰岛素信号通路,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢和甘油磷脂代谢通路等。通过部分mi RNA的实时荧光定量PCR结果验证了建库的可靠性。对哈萨克羊mi R-200a/b/c进行组织表达谱分析,结果发现mi R-200a/b/c在生殖系统垂体、子宫和输卵管中表达量较高。(3)?以荧光素酶表达结果显示:共转染GNAQ-3’UTR-psi-CHECKTM-2和pri-mi R-200b-pc DNA3.1(+)的hela细胞组是只转染psi-CHECKTM-2的hela细胞组荧光素酶值的77.5%;其余两组与只转染psi CHECKTM-2的hela细胞组之间的差异没有统计学意义。?下丘脑细胞转染实验结果发现,mi R-200b干扰组和对照组相比,GNAQ基因显著下调,下游ITPR,PRKCB,GNA1和MAP3K1,发情关键基因GPR54,KISS1和Gn RH显著上调。?卵巢颗粒细胞转染结果发现,mi R-200b干扰后,GNAQ基因表达量升高,下游基因COMT,HSD3B1,CYP1A1和PKA表达量下降。结论:(1)通过靶基因及相关发情通路分析,总结出从酪氨酸和叶酸两种营养物质出发,有别于光周期调控发情的通路:以PI3K基因为中心,下游通过PI3K-AKT通路作用于MEK1基因,或者通过白细胞跨内皮迁移通路作用于MMP14基因,继而作用于MEK1基因,MEK1基因通过Gn RH通路作用于FSH和LH。MEK1还可以通过FcγR-介导吞噬通路作用于PLA2G4A,再通过卵巢类固醇合成通路作用于ALOX5进而影响雌二醇和瘦素的分泌。PI3K基因上游,Rap1通过白细胞跨内皮迁移通路作用于PI3K,多巴胺受体基因通过Rap1信号通路作用于Rap1,多巴胺通过多巴胺突触通路作用于多巴胺受体,其上游受到酪氨酸的调控。至此建立一条从酪氨酸出发的营养调控发情的通路,和光调控发情的通路有所不同。另外,叶酸可以通过内吞作用通路作用于SMAD7,继而作用于下游的SMAD2/3,SMAD2/3通过作用于SMAD4促进雌二醇产生进而影响发情。以上通路的探讨为完善非季节性营养调控绵羊发情网络奠定基础。(2)通过细胞水平验证试验发现mi R-200b真实靶向调控GNAQ基因,并可能通过靶向作用GNAQ基因调控发情过程。