背景大肠癌(Colorectal Cancer, CRC)包括结肠癌和直肠癌,是消化系统常见恶性肿瘤之一,世界卫生组织数据库显示,全球每年新增约100万大肠癌患者,死亡51万例,为第三号癌症杀手。过去10年里,在大肠癌发病风险较低的地区,其发病率快速上升。全国调查数据显示,我国大肠癌死亡率也处于显著上升态势。大肠癌的发生是一个多因素、多步骤的过程,是环境致癌因素和遗传易感因素共同作用的结果。研究发现,大肠癌预后与早期诊断密切相关。截止目前,已经证明用结肠镜和乙状结肠镜进行早期筛查和诊断可有效降低大肠癌的发病率和死亡率。然而,尽管这些方法有相对高的敏感性和特异性,但它们是一种侵入式检查方法而且价格很贵,不适于大众普查。随着分子生物学、遗传学和生物技术的发展,近几年来我国在大肠癌的基础、临床和预防方面的研究取得了较大的进展,但迄今为止对其发病、复发、转移机制的了解仍然十分缺乏。对高危人群(年龄在40以上、有大肠癌家族史或肠息肉患者)进行普查能早期发现大肠癌,但当大肠癌病变较小时,临床无明显表现,癌胚抗原(Carcinoma embryonic antigen,CEA)等肿瘤标志物特异性又不高,结肠镜检查目前尚未完全普及,所以目前大肠癌的早期诊断还缺乏简易有效的手段。因此,寻找一种新的简便易行的可应用于大肠癌筛查、诊断、判断预后、治疗监测的肿瘤标志物就显得十分重要。鉴于线粒体在能量代谢、氧自由基生成和细胞凋亡中的特殊地位,特别是线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)测序的完成,人们逐渐认识到肿瘤的生物学特征不仅取决于核内遗传物质,而且与核外的线粒体DNA的变异有着非常重要的关系。人类每个细胞包含102~104个线粒体,每个线粒体DNA约有2~10个基因拷贝,线粒体DNA含16569个碱基对(Base pair, bp),为一环状双链DNA分子。线粒体DNA无内含子,与核基因不同,线粒体DNA缺乏组蛋白的保护和有效的修复机制,它更易于受到活性氧族(Reactive Oxygen Species, ROS)及其他基因毒性的损害,成为致癌作用的靶点。这使得线粒体DNA具有不同于核DNA的显著特点,包括高拷贝数、高突变率、高度多态性、严格的母系遗传等。线粒体DNA的突变及拷贝数异常与肿瘤的发生发展密切相关,而且线粒体DNA的异常具有显著的肿瘤特异性。目前已在多种实体肿瘤细胞中发现mtDNA突变及拷贝数的变化,并在肿瘤病人的白细胞中也检测到这种突变,但其在肿瘤发生和发展过程中具体的生物学意义尚不清楚。本课题研究的目的在于发现大肠癌患者外周血(peripheral blood lymphocytes,PBLs)中mtDNA拷贝数变异的特征与规律以及mtDNA拷贝数在大肠癌患者外周血和大肠正常组织中的相关性,以探讨可否用外周血代替组织来研究mtDNA拷贝数变异与大肠癌发病风险及预后之间的关系,并有望为将来大肠癌的早期诊断及预后评估提供新的简易有效的标志物,以期能早期发现大肠癌,提高大肠癌患者的生存期。方法1.采用病例-对照实验设计方法,纳入320例来自西安第四军医大学附属医院唐都医院的年龄为22-87岁的原发大肠癌患者和320例22-88岁健康人作为对照。所有入选病例组的患者均为首次确诊为大肠癌,所有入组研究对象均未进行过放化疗。病例组的纳入没有严格的年龄、性别和疾病分期的限制。320例健康对照是来自在同一时期到唐都医院进行体检的健康人,没有肿瘤史(良性黑色素瘤除外)。对照组与病例组在性别、年龄(±3岁)、居住地上严格配对。所有研究对象均为汉族。2.采集320例大肠癌患者和320例健康对照的外周血,并从病例组中随机收集10例大肠癌患者的正常大肠组织,用Omega Blood﹠Tissue DNA提取试剂盒提取血液DNA及组织DNA,-40℃冰箱保存。3.应用实时定量聚合酶链反应(real-time Quantatitative Polymerase Chain Reaction,real-timeQPCR)测定入选病例组及对照组研究对象外周血中线粒体DNA拷贝数,并检测10对外周血及大肠组织(每对外周血和大肠组织均来自同一个体)中的线粒体DNA拷贝数。4.在获取知情同意书后,收集所有研究对象的年龄、性别、吸烟、饮酒、受教育程度、身体质量指数(body mass index,BMI)、饮食情况、家族肿瘤史、环境暴露情况、体力活动、使用非甾体抗炎药(Non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)及激素替代疗法(Hormone replacement therapy,HRT)情况以及病人的手术时间、肿瘤位置、肿瘤病理类型、病理分级、临床分期、化疗情况等临床资料,并进行术后治疗、复发、转移、死亡等情况的随访。5.运用SPSS16.0软件包分析大肠癌患者外周血和大肠组织中线粒体DNA拷贝数的相关性、外周血线粒体DNA拷贝数与大肠癌发病风险及预后之间的关系。以优势比(odds radio,OR)、危险比(hazard radio,HR)和95%可信区间(confidence interval,CI)来估计mtDNA拷贝数与CRC发病风险及预后之间的相对危险度。所有P值都是双尾,P<0.05或95%可信区间(CI)不包括1.0认为有统计学意义。结果1.研究对象一般资料的分布特征病例组与健康对照组在性别(P=1.00)和年龄(58.42±13.12 vs. 58.16±13.53岁, P = 0.807)上具有很好的匹配性,在饮酒(P=0.395)、受教育程度(P=0.169)、BM(IP=0.632)以及非甾体抗炎药的使用(P=0.477)上无统计学差异,病例组中吸烟的人数和吸烟量均比健康对照组中的要多(39.37% vs. 32.81%, P = 0.084;26.2±14.94 vs 20.29±13.05包/年,P=0.002)。板子间和板子内的平均变异系数分别为6.9%(3.9%-9.1%)和4.2%(2.4%-6.9%)。2.线粒体DNA拷贝数的分布特征大肠癌患者外周血中线粒体DNA拷贝数(median: 1.03; range = 0.46- 3.37)比健康对照外周血中线粒体DNA拷贝数(median: 0.86; range = 0.48-3.06)要高,二者存在显著性差异(P<0.001)。进一步分层分析我们发现,在病例组和对照组中,性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒对线粒体DNA拷贝数均没有影响(P值范围:0.151-0.909)。3.外周血中及正常大肠组织中线粒体DNA拷贝数的相关性分析运用Pearson相关分析对10对大肠癌患者外周血及大肠组织中线粒体DNA拷贝数的相关性进行评估发现,大肠癌患者外周血中线粒体DNA拷贝数与大肠组织中线粒体DNA拷贝数具有很好的相关性(r = 0.659, p = 0.038)。4.线粒体DNA拷贝数与大肠癌发病风险的关联分析运用非条件logistic回归分析线粒体DNA拷贝数与大肠癌发病风险之间的关系发现,与线粒体DNA拷贝数低的相比,线粒体DNA拷贝数高的患大肠癌的风险显著增高(adjusted OR = 2.04, 95% CI = 1.48-2.82)。进一步进行四分位法分析发现,大肠癌发病风险与外周血中线粒体DNA拷贝数呈剂量依赖关系(P<0.001)。分层分析发现高的线粒体DNA拷贝数与大肠癌发病风险的相关性不受其他因素的影响。5.线粒体DNA拷贝数与大肠癌预后的关联分析随访了320例大肠癌患者,其中失访37例,另有6例不符合入组标准,有277例手术的腺癌病人纳入了预后分析。Cox回归模型进行多因素分析发现,年龄、性别、吸烟、饮酒、肿瘤位置、受教育程度对预后没有明显的影响(adjusted HR:0.74-1.34);临床分期、肿瘤分级与预后明显相关,临床分期越高预后越差(以0/I期为参考,从II期到Ⅳ期,adjusted HR分别为6.81、11.98、25.48),肿瘤病理分化越差患者预后越差(以高度分化为参考,中度分化及低度分化的adjusted HR分别为1.55、2.53);与不化疗的患者相比,术后实施辅助化疗可明显降低患者死亡风险(adjusted HR=0.57);线粒体DNA拷贝数与大肠癌复发(P=0.008)和死亡(P=0.007)显著相关,外周血中线粒体DNA拷贝数高的患者要比拷贝数低的患者预后差(复发和死亡的adjusted HR分别为1.87、2.01)。采用Kaplan Meier法进行分析发现,线粒体DNA拷贝数高的患者与线粒体DNA拷贝数低的患者相比,其生存率明显要差(Log rank P=0.002)。结论1.大肠癌患者外周血中线粒体DNA拷贝数与其大肠组织中线粒体DNA拷贝数有显著相关性。这就证明可以用外周血中的线粒体DNA拷贝数来代替肠组织中的线粒体DNA拷贝数进行其变异的检测。2.大肠癌患者外周血中线粒体DNA拷贝数增高与大肠癌发病风险显著相关,高的线粒体DNA拷贝数具有高的大肠癌发病风险,二者呈剂量依赖关系。3.大肠癌患者外周血中线粒体DNA拷贝数与其预后显著相关,线粒体DNA拷贝数高的患者预后较差。从以上结论我们推测,外周血中线粒体DNA拷贝数可能会成为大肠癌发病风险评估及预后监测的一种标志物。