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肝癌的恶性程度高，发生发展迅速，预后不良。因此对其发生和发展的机制进行研究显得很有必要。支架蛋白MAGI-2(Membrane-associated guanylate kinase inverted-2)是一个包含多个功能结构域的蛋白质，主要功能是作为一个支架蛋白在细胞膜处募集和锚定一些细胞信号蛋白形成高分子复合体，从而发挥细胞信号转导的作用，并且能够稳定锚定处细胞膜的结构。MAGI-2基因定位于人染色体7q21，曾被认为是一个潜在的肿瘤抑制基因。但是，目前对其抑制肿瘤细胞生物学行为的相关信号通路的研究不是很多，对其分子机制的了解并不完全清楚，对其进行研究可以为临床治疗肝癌提供新的思路和治疗手段。因此，我们拟从基本的信号转导通路着手，探讨MAGI-2蛋白质信号转导通路对肿瘤细胞迁移和增殖的影响及相应的分子机制。
第一部分 MAGI-2对人肝癌细胞的迁移和增殖的抑制作用已有研究表明，MAGI-2蛋白质也称S-SCAM(synaptic scaffolding molecule)，是一个170KDa大小，在脑组织中高表达，而在其他组织中低表达的蛋白分子。在此研究中，我们首先选择了八株人肝癌细胞，检测其是否有MAGI-2蛋白质的表达，结果显示：只有SMMC-7721细胞中有MAGI-2的表达。既然人肝癌细胞中存在MAGI-2蛋白质的表达，说明MAGI-2在肝癌的发生发展过程中发挥一定的作用。为此，我们从中选择了三株肝癌细胞：SMMC-7721(以下统称为7721)(有MAGl-2蛋白质表达)，BEL-7404(7404)和MHCC-97H(97H)(没有MAGI-2蛋白质表达)。在此三株细胞中转染带myc标记的MAGI-2表达质粒，用抗myc抗体检测是否转染成功。转染成功后，在此三株细胞中行划痕法检测细胞迁移能力的变化，为了避免细胞增殖对迁移的影响，我们先用羟基尿处理细胞使其增殖受到抑制，另外又行transwell法进一步验证这个结果。并且，行MTT法和流式细胞检测细胞增殖能力的变化。结果显示，在此三株细胞中转染myc-MAGI-2质粒后，细胞迁移和增殖能力均受到抑制，且细胞发生G1期阻滞。同时，我们还进一步用western blot方法检测转染后此三株细胞中FAK信号通路、P13K/Akt信号通路和MAPK信号通路中的信号分子的变化，发现中FAK和Akt蛋白质的总量没有明显的变化，但是FAK和Akt的磷酸化水平却显著降低，并且与细胞增殖密切相关的p27蛋白质水平也相应升高。但是，ERK1/2蛋白质的总量和磷酸化水平均没有明显的变化。综上所述，该部分实验结果提示：MAGI-2蛋白质对人肝癌细胞的迁移和增殖都有抑制作用，并且该抑制作用与FAK和Akt的磷酸化密切相关，而与ERK1/2的磷酸化关系不大。
第二部分 PTEN参与MAGI-2对人肝癌细胞迁移和增殖抑制的分子机制的研究PTEN蛋白质是一个具有双专一性磷酸酶活性的抑癌基因的产物，其脂质磷酸酶活性能够促进PIP3的3位脱磷酸化，影响Akt及其后的信号通路的活化。PTEN通过PI-3K/Akt信号途径发挥抑制细胞生长和诱导细胞凋亡两种作用。其蛋白磷酸酶活性能下调FAK的磷酸化，从而发挥抑制肿瘤细胞侵袭、阻断细胞的局部粘附与迁移的作用。MAGI-2对人肝癌细胞的迁移和增殖的抑制作用是否可能通过PTEN发挥作用，值得深入研究。结果显示，转染myc-MAGI-2质粒后，三株细胞中PTEN蛋白质表达水平都升高。用半定量RT-PCR方法检测此三株细胞中PTEN mRNA水平的变化和CHX(cycloheximide)处理7721细胞后western blot检测其PTEN半衰期的变化，结果显示，myc-MAGI-2质粒转染细胞后，并不影响PTEN mRNA水平，但是PTEN蛋白质的降解速度减慢。应用有效的针对PTEN的RNA干扰技术，进一步探讨了PTEN在MAGI-2抑制细胞迁移和增殖效应中的作用。结果显示，在人肝癌7721细胞中，PTEN的mRNA被干扰后，其蛋白质表达下调，细胞迁移和增殖能力升高，FAK和Akt的磷酸化水平发生上调。再转染MAGI-2表达质粒，对PTEN蛋白质的影响很小，细胞迁移和增殖能力几乎没有变化，同时对FAK和Akt的磷酸化水平影响也很小。综上所述，该部分实验提示：PTEN参与了MAGI-2对人肝癌细胞迁移和增殖的抑制作用，且PTEN蛋白质的上调是MAGI-2抑制细胞迁移和增殖所必须的。
第三部分进一步在U87MG细胞和Hela细胞中验证PTEN参与MAGI-2对肿瘤细胞迁移和增殖的抑制作用既然，在人肝癌细胞中，转染MAGI-2表达质粒能通过下调FAK和Akt的磷酸化水平达到抑制细胞迁移和增殖的效应，且PTEN蛋白质在此过程中发挥了重要的作用。为进一步研究PTEN在MAGI-2诱导的细胞迁移和增殖抑制中的作用，我们选择了两株人的肿瘤细胞，胶质瘤细胞-U87MG细胞(仅有PTEN mRNA，无PTEN蛋白质表达)和宫颈癌细胞-Hela细胞(有野生型PTEN蛋白质表达)。首先，我们检测这两株细胞中PTEN和MAGI-2的表达情况，以7721作为阳性对照，结果显示，U87MG细胞中没有PTEN蛋白质的表达，但是MAGI-2蛋白质能被检测到。Hela细胞中则有PTEN蛋白质的表达。其次，我们将myc-MAGI-2质粒分别转染至这两株细胞中。其实验结果与我们前面得到的结论一致，U87MG细胞转染myc-MAGI-2质粒后，行transwell法检测的U87MG细胞迁移能力并没有出现明显的改变，用MTT法检测的U87MG细胞增殖能力也没有发生明显的变化，且信号蛋白p-FAK，p-AKT和p-ERK1/2的水平也均没有明显的降低。而在Hela细胞中转染myc-MAGI-2质粒后，p-FAK，p-AKT和p-ERK1/2的水平则发生显著降低。综上所述，该部分实验结果进一步验证了PTEN蛋白质的上调是MAGI-2抑制肿瘤细胞迁移和增殖所必须的。