华支睾吸虫病(clonorchiasis)，亦称肝吸虫病，是由华支睾吸虫(Clonorchis sinensis，C．sinensis)感染引起的一种食源性人兽共患寄生虫病，流行于中国、韩国、及其它东南亚国家，全世界有将近3500万人感染华支睾吸虫，我国是最主要的流行区，感染人数约为1249万。华支睾吸虫病主要流行于有生食淡水鱼虾习惯的地区，生食或食入未煮熟的含囊蚴的鱼、虾后华支睾囊蚴在十二指肠脱囊移入人或动物肝胆管中寄生，寿命可长达20多年，并可反复感染持续加重。因此，对华支睾吸虫的致病机制进行研究，特别是阐明华支睾吸虫感染引起肝纤维化或肝硬化的分子机制，对深入了解和防治华支睾吸虫病具有非常重大的科学意义。 1.研究目的和意义基于CsESAs，特别是磷脂酶类可能在华支睾吸虫的致病方面起重要作用，本课题将以下列研究为目标，初步探讨CsESAs及其组分蛋白在华支睾吸虫致肝纤维化／肝硬化过程中所起的作用. 2.CsESAs致大鼠肝纤维化的研究实验组大鼠用含DMEM的CsESAs腹腔注射，猪血清腹腔注射为阳性对照、DMEM腹腔注射为阴性对照，同时设立免疫攻击组(先以佐剂乳化后的CsESAs皮下注射，动物产生抗体后用相同剂量的CsESAs腹腔注射)。动物取血后处死，制备肝脏石蜡切片，HE染色和masson染色观察肝脏病理变化；荧光免疫组织化学法观察CsESAs在肝脏中的定位和α-SMA在在肝脏中的表达。ELISA法检测各组动物血清中抗CsESAs抗体滴度。 3.CsESAs刺激体外培养的人肝星状细胞株LX-2增殖和活化用含DMEM的CsESAs刺激体外培养的人类肝星状细胞株LX-2，免疫细胞化学法确定CsESAs是否与人类肝星状细胞株LX-2细胞膜的结合；应用MTT法测定CsESAs对LX-2细胞有无增殖作用并用流式细胞仪分析CsESAs对细胞周期的影响；半定量RT-PCR和分子探针(molecular beacon)分析CsESAs对细胞活化情况的影响。 4.两个磷脂酶基因(CsLPAP、CsGⅢsPLA2)的生物信息学分析及其克隆、表达、纯化华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库进行表达序列标签(expression sequence tag，EST)随机测序和unigene归并，获得一大批华支睾吸虫成虫全长基因，用BLASTx方法搜索GenBank中与之同源的蛋白序列，从中识别出溶血磷脂酸特异性磷脂酶(CsLPAP)和Ⅲ型分泌型磷脂酶A2(CsGⅢsPLA2)。利用生物信息学软件对这两个基因和其它物种已知的同名基因序列进行同源性比对；分析蛋白分子的组成、功能域、活性位点等，进而预测其生物学功能。应用分子克隆技术分别构建两个基因的原核表达质粒，在大肠杆菌中表达，用亲和层析技术纯化目的蛋白，并做SDS-PAGE分析。 5.两个磷脂酶为华支睾吸虫成虫分泌／排泄抗原的鉴定应用Western blotting方法，分别用华支睾吸虫成虫ESAs的大鼠免疫血清、重组蛋白的大鼠免疫血清，以及免疫前的大鼠阴性血清作为一抗对华支睾吸虫成虫的ESAs进行识别；同时用相同的抗体对两个重组蛋白分别进行识别，DAB(二氨基联苯胺)法显色。 研究结果： 1.CsESAs的收集、抗体制备成虫培养12h收集的CsESAs蛋白含量为0.2mg/mL，SDS-PAGE显示CsESAs分子量主要在7-66kDa之间，成分复杂。用CsESAs分别免疫大鼠和小鼠，得到的抗CsESAs多克隆抗体效价分别为1：12800和1：9600。 2.CsESAs致肝纤维化动物模型的建立肝脏石蜡切片masson染色后可观察到注射猪血清的标准阳性组8只大鼠均表现出典型的肝硬化特征；实验组大鼠均表现出肝脏纤维的增生，部分大鼠肝小叶出现明显的纤维间隔；免疫攻击组亦表现出肝脏纤维的增生但程度较实验组轻；阴性对照组肝组织无病理变化。荧光免疫组织化学法观察到CsESAs在实验组、免疫攻击组大鼠肝脏的血管内壁和肝窦内皮均有附着；α-SMA在阳性组、实验组大鼠肝脏中的表达明显较免疫攻击组、阴性对照组高。间接ELISA显示免疫攻击组动物血清中抗CsESAs抗体滴度远高于实验组，阳性组和阴性对照组未检测到抗CsESAs抗体。以上结果表明CsESAs可以直接诱导大鼠肝脏发生纤维增生并发展为肝硬化。 3.CsESAs刺激体外培养的人类肝星状细胞株LX-2增殖和活化的分析荧光免疫细胞化学法结果显示CsESAs可与人肝星状细胞LX-2细胞膜结合。MTT法显示CsESAs对LX-2细胞的增殖作用在一定范围内呈剂量依赖性，流式细胞仪对细胞周期的分析表明CsESAs可促进LX-2细胞进入增殖期(G2+S期)；半定量RT-PCR分析了CsESAs作用后的LX-2细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP2)表达量均有增加，特异性结合与人类Ⅲ型胶原蛋白mRNA的分子探针(molecular beacon)也显示了与之相一致的结果，提示CsESAs对体外培养的人类肝星状细胞株LX-2具有促进增殖和活化的作用。 4.两个磷脂酶基因(CsLPAP、CsGⅢsPLA2)的生物信息学分析及其克隆、表达、纯化CsLPAP基因的ORF从第1位到1326位含1326bp，终止密码为’FAG，编码441个氨基酸，理论分子量为48.8kDa，1aa-18aa为分泌信号肽序列。多重序列比对结果显示CsLPAP的氨基酸序列与日本血吸虫、斑马鱼、人、小鼠、猩猩的LPAP氨基酸序列一致性分别为45％、32％、29％、27％、28％。CsLPAP具有酸性磷脂酶共有的N端序列LXXVXXVXRHGXRXP且其氨基酸序列中24Gln-362Glu为组氨酸活性磷脂酶的催化区域。此基因序列已获GenBank登录号：DQ974197。双酶切和测序证实pET-28a-CsLPAP重组质粒构建成功，原核表达后12％SDS-PAGE分析显示目的条带分子量在45kDa-66.2kDa之间，与理论分子量相符。菌体超声裂解后上清中有相应的表达条带，超声裂解后的上清液经His结合树脂亲和层析纯化，SDS-PAGE分析显示获得了纯度较高的重组蛋白。 CsGⅢsPLA2基因的ORF从第57位到941位含885bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA，编码294个氨基酸，理论分子量为33.7kDa，1aa-19aa为分泌信号肽序列。 结论： 1.以CsESAs腹腔注射Wistar大鼠发现CsESAs可以致大鼠肝纤维化，进一步的研究发现HSC活化是CsESAs致肝纤维化产生的重要原因，但抗原-抗体复合物不是CsESAs引起HSC的活化和肝纤维化的主要途径。 2.CsESAs可与体外培养的人肝星状细胞株LX-2结合，促进LX-2细胞进入G2和S期，并增加细胞内Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP2表达，说明CsESAs可促进LX-2细胞的增殖、活化。 3.成功构建了pET-28a-CsLPAP和pET-28a-CsGⅢsPLA2原核表达载体，细菌培养物经过IPTG诱导表达出重组融合蛋白，用亲和层析方法获得纯化的CsLPAP和CsGⅢsPLA2重组蛋白。 4.免疫印迹分析提示CsLPAP和CsGⅢsPLA2两个蛋白均为CsESAs成分，其中CsLPAP主要定位于虫体的消化、生殖系统，进一步证明CsLPAP是华支睾吸虫的ESA。CsGⅢsPLA2不仅氨基酸序列具有GⅢsPLA2的特征，而且CsGⅢsPLA2重组蛋白具有水解蛋黄卵磷脂的活性。 　　5.CsLPAP和CsGⅢsPLA2蛋白均可以与LX-2细胞结合，但只有CsGⅢsPLA2重组蛋白对LX-2细胞有促进增殖和活化的作用，提示该蛋白可能是致宿主肝纤维化的有效成分之一。 6.用蛋白组学技术对华支睾吸虫成虫的分泌／排泄抗原进行分析鉴定，发现大多数的CsESAs为细胞因子和酶类，说明分泌／排泄抗原可能是寄生虫入侵宿主、获取营养及致病的关键因素，而且鉴定出的能够与LX-2细胞结合的CsESAs成分均是具有广泛生物活性的细胞因子和酶，其中包括了磷脂酶类，为CsESAs可直接激活肝星状细胞导致肝纤维化提供了有力佐证。