副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)为巴氏杆菌科的一种短小革兰氏阴性杆菌,是感染猪的一种呼吸道病原菌,其与其它呼吸道病原共同作用,可引起猪呼吸道疾病综合征。但由于对此菌研究时间较短,人们对其致病机理、生理特性还了解较少,尤其是在分子生物学方面,主要还是在对其个别基因的功能进行研究。 细菌aroA基因编码产物为5’-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthetase,EPSPS),参与芳香族氨基酸的生物合成,是细菌芳香族氨基酸代谢通路中一个非常重要的酶,该酶活性的缺失会导致细菌生长迟缓,毒力降低等生物学变化。目前,在许多革兰氏阴性菌中都有关于aroA基因的报道,主要是利用aroA基因对细菌进行分类及血清分型,也有一些报道称通过基因工程手段可构建aroA基因突变失活的细菌减毒减活突变株。 本文在国内外首次利用PCR和细菌染色体步移技术自副猪嗜血杆菌15个血清型的17个参考菌株和3个国内分离株基因组DNA中获得包含完整aroA基因的基因片段,其中aroA基因全长1314 bp,编码产物长度为437 aa,分子量大小为47.9 kDa。对各血清型aroA基因进行比对分析结果显示核酸序列同源性在97.7％以上,相互之间无显著差异。与巴氏杆菌科其它成员aroA基因序列比较,同源性70.6％～78.9％,表明aroA基因不仅在副猪嗜血杆菌各血清型间是高度保守的,而且在巴氏杆菌科的许多成员中也是一个相对保守和遗传稳定的基因。在成功获得Hps各血清型aroA基因基础上,深入探讨该基因与Hps的血清型之间的联系,无法通过不同血清型的aroA基因对Hps进行血清分型,推断两者之间不存在显著相关性。另外,通过Hps各血清型aroA基因的序列分析也无法看出该基因与不同毒力的菌株间存在直接对应关系。因此,着想进一步研究aroA基因在Hps中的生物学功能以及与菌株毒力的关系,必须通过更多的实验进行探究。 本文在Hps aroA基因的鉴定成功的基础上,利用PCR技术扩增出Hps血清5型aroA基因及其上下游约3640bp的基因片段,经克隆测序后在aroA基因上游HindIII位点插入大小为0.9 kb的氯霉素抗性基因片段,成功构建转移载体pTA-Chlr。为构建Hps aroA基因失活突变菌株,进一步研究aroA基因在Hps中的生物学功能奠定了基础。