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在世界范围内，目前结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)发病率在恶性肿瘤中排名第三，死亡率排名第四，近年来我国结直肠癌的发病率和死亡率不断呈攀升趋势。关于结直肠的治疗在近10年得到了长足的进展，一些新的理念为结直肠癌的治疗带来了亮点，特别是关于肿瘤部位对结直肠癌治疗疗效及预后的影响，更改了治疗指南，为精准治疗提供了新的方向。目前，最公认的划分方法是，按照胚胎起源，以结肠脾区为界将结肠癌分为左半结肠癌(Left-sided colon cancer,LSCC )与右半结肠癌(Right-sided colon cancer,RSCC)。LSCC与RSCC在解剖结构、临床表现、肠道菌群及对治疗反应及预后方面均存在差异。在临床中，根据肿瘤部位为患者选择精准的治疗是治疗的重点也是难点。从基因水平层面来讲，LSCC与RSCC患者属于不同的群体，文献报道RSCC患者更多发生微卫星不稳定(Microsatellite instability，MSI)，KRAS与BRAF的突变，且microrna-31的表达存在异常；而LSCC患者更多发生染色体不稳定(Chromosomal instability ， CIN )，P53、NRAS突变，microrna-146a,microrna-147b,和microrna-1288的异常表达有关。但是，LSCC与RSCC准确的生物标志物与明确的分子特征尚不清楚。对于精准治疗的需求，迫切需要找到LSCC与RSCC准确的生物标志物及导致其差异的机制。
蛋白质是机体工作的主要物质，几乎参与了细胞活动的每一个过程。越来越多的证据表明，特定的蛋白质可能是恶性肿瘤的重要生物标志物，是治疗癌症的潜在治疗靶点。本研究旨在寻找出在RSCC与LSCC中存在表达差异并发挥作用的蛋白质，并探究其具体的功能及作用机制，最终锁定TRIM29，其在结肠癌中高表达，且在RSCC中较LSCC升高更为显著，为LSCC及RSCC中存在差异的特异标志物。
胚胎起源导致左右半结肠发育及分化的不同是左右半结肠癌存在差异的根本原因，应用JASPAR软件筛选与TRIM29启动子区匹配且具有调节分化、发育功能的转录因子，锁定GATA2为调节TRIM29的转录因子。GATA2是一种经典的核转录因子，被认为是促进造血和及监测心脏分化
的重要因子，通过直接与调控因子的启动子的结合而抑制其表达。已经报道一些肿瘤与GATA2的功能障碍有关，如白血病和前列腺癌。此外，多项研究表明，在中胚层生长分化过程中，GATA2起着重要的作用。因此，相对于LSCC，GATA2的功能异常在RSCC中的发生发展可能发挥更重要的作用。
我们之前应用mRNA芯片技术(GEO编码：GSE110204)检测出了在结肠癌组织与癌旁之间存在差异的可编码蛋白质的众多mRNAs。为了筛选更有意义的能编码蛋白质的差异mRNA，将4.5倍差异及-log10P＞5作为截取值，锁定4个候选的mRNAs，分别能编码KLK6，CDH3，CST1及TRIM29。在55对配对的结肠癌及癌旁组织中检测4种蛋白的表达水平，并分析其在LSCC与RSCC中是否存在差异。结果显示，TRIM29在结肠癌组织中较癌旁组织高表达，且在RSCC中表达高于LSCC，确定TRIM29为目的蛋白。为观察TRIM29对结肠癌细胞功能发挥的作用，在结肠癌细胞中敲降TRIM29及过表达TRIM29，通过xCELLigenceRTCAMP系统、Transwell实验及克隆生长实验分别观察TRIM29对功能的影响。分别在10对LSCC及RSCC中检测GATA2的表达水平，表明RSCC较LSCC更为低表达。应用免疫组化方法(Immunohis-tochemistry，IHC)检测相同组织芯片中TRIM29及GATA2的表达水平，分析二者的相关性，结果证实了GATA2与TRIM29存在负相关，并进一步在结肠癌细胞中过表达GATA2，检测TRIM29表达水平的变化，验证了GATA2能够抑制TRIM29的表达。通过双荧光酶报告基因实验，在结肠癌细胞中验证了GATA2转录抑制TRIM29的表达。
应用免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)及质谱分析(Mass spectr-ometry ， MS )的方法检测TRIM29下游的靶基因是丙酮酸激酶1/2(Pyruvate Kinase M1/2，PKM1/2)，敲降TRIM29而导致结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移的能力的减弱是通过作用于PKM1/2而实现的。体内及体外实验证实，TRIM29能够泛素化降解PKM1及PKM2，其中主要降解PKM1，导致PKM1/PKM2的比值下降，PKM1与抑制肿瘤增殖有关，而PKM2在促进肿瘤增殖方面起关键作用。PKM1/PKM2比值决定了葡萄糖分解代谢的方向，文献报道证实结肠癌受能量代谢的调节。本研究利用海马细胞外通量分析仪XF96(Seahorse Bioscience)在体外监测结肠癌细胞细
胞代谢变化，结果证实TRIM29的过表达通过降低PKM1/PKM2比值导致肿瘤细胞糖酵解能力增强，氧化磷酸化能力减弱。本研究共分为四部分内容。
第一部分TRIM29在结肠癌组织中的表达及其在左右半结肠癌中的表达差异
目的：筛选并锁定在结肠癌发生过程中起关键作用，并在LSCC及RSCC患者中差异表达的关键分子。
方法：对之前10对结肠癌与癌旁组织芯片的结果设定截取值进行筛选，并在CCLE数据库中查寻候选蛋白在结肠癌细胞株中的表达情况，确定出在结肠癌发生中扮演重要作用的候选蛋白；应用免疫组化方法检测55对结肠癌与癌旁组织中候选蛋白所表达的蛋白水平，观察是否存在差异，并应用χ2检验进一步按照肿瘤部位进行分析，并应生物信息学分析左右半结肠差异的mRNA，最终锁定TRIM29为在LSCC及RSCC中表达差异的蛋白；应用qPCR检测TRIM29在46对配对的癌及癌旁组织的mRNA表达水平，应用t检验探讨TRIM29-mRNA表达水平在癌与癌旁组织的差异及在LSCC及RSCC中的差异。应用WesternBloting方法检测TRIM29在8对癌及癌旁组织中的表达水平；应用χ2检验分析不同TRIM29表达水平与分期及淋巴结转移的关系；应用Kaplan-Meier方法及Log-rank检验分析不同TRIM29水平间生存率的差异。
结果：
1.与结肠癌发生相关关键mRNA的筛选。芯片(GEO编码：GSE110204)检测出1605条在结肠癌组织中高表达的mRNA及1606条低表达的mRNA。将foldchange＞4.5和-log10P＞5设为截取值，最终锁定4条可编码CDH3、CST1、KLK6及TRIM29的mRNAs作为候选基因；
2.RSCC与LSCC中差异蛋白的确定。应用免疫组织化学染色方法在55对配对的结肠癌组织及癌旁正常组织石蜡切片中检测4个候选基因CDH3、CST1、KLK6及TRIM29的蛋白表达情况。结果发现四种蛋白均在癌组织中有不同程度的升高。将55例患者分为LSCC及RSCC为2组，其中20例为RSCC，35例为LSCC。结果发现，TRIM29在RSCC中的强烈表达(+++)的概率明显高于LSCC(P＜0.001)，其他3种蛋白在两
组中的水平无明显差别。且结合RSCC及LSCC中差异mRNA的生物信息学分析，确定TRIM家族在结肠癌组织中高表达，且在LSCC及RSCC中的表达存在差异，为研究对象。
3.TRIM29在结肠癌组织的mRNA表达水平较癌旁组织升高(P=0.014)，其中RSCC中TRIM29的mRNA表达水平较LSCC升高(P=0.03)。
4.TRIM29高表达与淋巴结转移及更差的分期相关(P分别为0.018，＜0.001)，并与较差的总生存期(Overall survival，OS)有关(P=0.005)。TRIM29低表达组患者OS为24个月，高表达组中位OS为64个月。
第一部分TRIM29对结肠癌细胞生物学行为的影响
目的：探讨TRIM29在体内及体外对结肠癌细胞生物学行为的影响。
方法：构建过表达TRIM29的质粒及敲降TRIM29的SiRNA，在SW480及DLD-1细胞株转染SiRNA敲降TRIM29，在DLD-1及HCT116细胞株转染质粒过表达TRIM29，分别作用48小时后，利用xCELLigenceReal-TimeCellAnalyzer(RTCA)-MP系统观察并统计细胞的增殖能力与对照组的差异；转染48后，进行transwell实验、细胞克隆实验，观察实验组及对照组侵袭迁移及细胞克隆形成细胞数，应用t检验分析实验组及对照组侵袭迁移及克隆的细胞数目是否存在差异。构建敲降TRIM29的稳转细胞株，验证稳转细胞功能，分别在10只裸鼠中左右肩皮下及5对裸鼠尾静脉注射对照空载细胞及稳转敲降细胞，观察皮下移植瘤及形成肝、肺转移瘤的数目，应用t检验分析实验组及对照组皮下移植瘤的重量及转移瘤的数目是否存在差异。
结果：
1.过表达TRIM29后，DLD-1及HCT116细胞的增殖能力较前增强；敲降TRIM29后，SW480及DLD-1细胞的增殖能力较前减弱；
2.转染过表达TRIM29的质粒(TRIM29 GFP)后，DLD-1GFP(空载)及DLD-1TRIM29GFP组迁移至膜下表面的细胞数分别为278±21及376±32；以上两组侵袭至膜下表面的细胞数分别为173±13及282±21。以上各组差异均具有显著统计学意义(P均＜0.001)。在HCT116GFP及HCT116TRIM29GFP组迁移至膜下表面的细胞数分别为149±16及211±15；以上两组侵袭至膜下表面的细胞数分别为158±14及201±17。以
上各组差异均具有显著统计学意义(P均＜0.001)。过表达TRIM29后，细胞的迁移、侵袭能力均有显著提高。
3.在SW480及DLD-1细胞株中应用SiRNA1及SiRNA2敲降TRIM29后，SW480TRIM29NC、SW480TRIM29Si1及SW480TRIM29Si2组迁移至膜下表面的细胞数分别为150±18，82±8及88±9；以上各组侵袭至膜下表面的细胞数分别为16±3，3±1及8±2。DLD-1TRIM29NC、DLD-1TRIM29Si1及DLD-1TRIM29Si2组迁移至膜下表面的细胞数分别为398±29，163±14及143±11，以上各组侵袭至膜下表面的细胞数分别为349±27，133±11及125±9，差异均具有显著统计学意义(P均＜0.001)。敲降TRIM29后，细胞的迁移、侵袭能力均有明显下降。
4.在DLD-1及SW480细胞株分别转染TRIM29NC及TRIM29SiRNA2，HCT116及DLD-1细胞分别转染GFP及TRIM29-GFP质粒，结果显示敲降TRIM29后，SW480NC、SW480SiRNA2、DLD-1NC、DLD-1SiRNA2各组形成细胞克隆的数目分别为103±7、25±3、13±2和3±1，SW480及DLD-1细胞的形成克隆的能力较前减弱(P均＜0.01)；过表达TRIM29后，DLD-1GFP、DLD-1TRIM29-GFP、HCT116GFP、HCT116TRIM29-GFP各组形成细胞克隆的数目分别为6±2，13±4，21±3，58±5，DLD-1及HCT116细胞形成克隆的能力较前增强(P均＜0.01)(图16)。
5.稳转敲降TRIM29的细胞株，其增殖、侵袭迁移及克隆能力均获得与瞬转一致的结果。
6.应用SW480及HT29稳转细胞进行体内实验，两株细胞Lenti-shTRIM29的皮下移植瘤均较Lenti-NC质量明显减轻(P分别＜0.01及P＜0.001)。HT29Lenti-shTRIM29肝转移及肺转移瘤数目均较HT29Lenti-NC组减少。
第三部分TRIM29上游调控机制的研究
目的：探讨并确定TRIM29的上游调控基因。
方法：应用公共数据库查阅TRIM29基因突变及拷贝数变化情况，并查阅文献了解非编码RNA在CRC调控TRIM29的可能性，最终锁定TRIM29受转录因子调控；应用JASPAR软件通过设置截取值匹配并筛选能识别TRIM29启动子的转录因子。查阅文献，选择具有调控生长分化功
能的转录因子，最终锁定GATA2为调控TRIM29的候选转录因子。应用GEPIA软件分析GATA2与TRIM29的相关性。构建过表达GATA2的质粒，过表达GATA2后，应qRT-PCR检测GATA2及TRIM29的mRNA表达水平。在DLD-1细胞株应用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunop-recipitation，ChIP)实验方法及在293T细胞株中应用双荧光素酶报告基因实验方法验证GATA2与TRIM29启动子相结合，并负调控TRIM29的表达。在10对配对的结肠癌与癌旁组织中检测GATA2的蛋白表达水平，观察其在RSCC及LSCC中的表达水平差异。
结果：
1.数据库中显示TRIM29基因突变及拷贝数变化发生的频率均很低，均不到1%；
2.GEPIA公共数据库结果显示GATA2及TRIM29表达存在显著负相关性。(R=-0.3，P＜0.001)；
3.过表达GATA2后，TRIM29的mRNA表达水平明显下降；
4.免疫共沉淀实验结果显示，GATA2抗体能将TRIM29启动子区的Primera、Primerb+c、Primerd三个区域沉淀下来，而对照组IgG抗体不能；
5.双荧光素酶报告基因实验结果证实，过表达GATA2后报告基因的活性被显著抑制。
第四部分TRIM29下游调控机制的研究
目的：寻找并锁定TRIM29的下游基因及具体调控机制
方法：应用免疫沉淀联合质谱的方法寻找TRIM29下游作用的蛋白。通过免疫共沉淀验证出TRIM29可与PKM1/2相互作用。过表达或敲降TRIM29后，应用qRT-PCR检测并应用t检验分析PKMmRNA的变化；应用WesternBloting检测并观察PKM1/2的蛋白表达情况。过表达TRIM29后，加入蛋白合成抑制剂放线菌酮(Cycloheximide，CHX)处理24h，WesternBloting实验观察PKM1/2蛋白稳定性的变化；过表达TRIM29后，加入蛋白酶体抑制剂MG132处理12小时，进行后续的泛素化Co-IP实验及WesternBloting实验观察PKM1/2的泛素化水平。应用免疫组化染色检测3个完全相同组织微阵列的GATA2、TRIM29、PKM1的蛋白表达水平，
应用Kendal’stau-b检验分析GATA2、TRIM29及PKM1蛋白表达的相关性。分别敲降TRIM29、过表达PKM1及PKM2，应用海马细胞外通量分析仪XF96(Seahorse Bioscience)，SeahorseXFGlycolysisStressTestKit(糖酵解压力测试试剂盒)和SeahorseXFCellMitoStressTestKit(线粒体压力测试试剂盒)(安捷伦科技)检测细胞外酸化率(ECAR)和耗氧量(OCR)的变化。应用TRIM29-GFP质粒过表达TRIM29，再分别过表达PKM1或PKM2进行细胞功能回复(Rescue)实验，观察并分析PKM1及PKM2能否逆转TRIM29所致的增殖、侵袭迁移、ECAR及OCR的变化。
结果：
1.免疫沉淀联合质谱分析显示，NT5E、SerpinB3、ANXA2、LDHA和PKM1/2为TRIM29候选下游基因；
2.免疫共沉淀验证出TRIM29能与PKM1/2相互作用；
3.过表达及敲降TRIM29后，PKM1/2的mRNA表达水平无明显变化，但PKM1/2蛋白表达水平降低及升高，PKM1的变化更为明显；
4.过表达TRIM29后，CHX处理24小时后，PKM1/2的蛋白稳定性减低；过表达TRIM29后，加入蛋白酶体抑制剂MG132处理12小时后，能检测到更多的PKM1/PKM2被泛素化标记，且二者相比PKM1这种现象更为明显；
5.GATA2、TRIM29及PKM1蛋白表达呈两两负相关(P值分别为0.023，0.003；Kendal’stau-bR分别为-0.389及-0.516)；
6.过表达PKM1后，细胞的糖酵解能力明显降低、氧化磷酸化能力明显升高，ECAR减低、OCR升高；过表达PKM2后，细胞的糖酵解能力明显升高、而氧化磷酸化能力稍有降低，ECAR升高及OCR降低；
7.在TRIM29-GFP质粒处理的细胞中，OCR、ECAR和细胞的增殖、侵袭、迁移能力能通过PKM1的过表达部分得以挽救，但PKM2的过表达则无法挽救其效应。
结论：
1.TRIM29在结肠癌患者癌组织中的表达显著高于配对癌旁正常组织，TRIM29在结直肠的发生发展中起重要作用；
2.TRIM29能促进结肠癌的恶性行为，且与淋巴结转移及较差的TNM分期及预后有关；
3.TRIM29在RSCC中的表达较LSCC表达升高，提示TRIM29可能做为左右半结肠癌差异的分子标志物；
4.TRIM29受GATA2转录负调控；
5.TRIM29主要泛素化降解PKM1，影响糖代谢而发挥抗肿瘤作用。
蛋白质是机体工作的主要物质，几乎参与了细胞活动的每一个过程。越来越多的证据表明，特定的蛋白质可能是恶性肿瘤的重要生物标志物，是治疗癌症的潜在治疗靶点。本研究旨在寻找出在RSCC与LSCC中存在表达差异并发挥作用的蛋白质，并探究其具体的功能及作用机制，最终锁定TRIM29，其在结肠癌中高表达，且在RSCC中较LSCC升高更为显著，为LSCC及RSCC中存在差异的特异标志物。
胚胎起源导致左右半结肠发育及分化的不同是左右半结肠癌存在差异的根本原因，应用JASPAR软件筛选与TRIM29启动子区匹配且具有调节分化、发育功能的转录因子，锁定GATA2为调节TRIM29的转录因子。GATA2是一种经典的核转录因子，被认为是促进造血和及监测心脏分化
的重要因子，通过直接与调控因子的启动子的结合而抑制其表达。已经报道一些肿瘤与GATA2的功能障碍有关，如白血病和前列腺癌。此外，多项研究表明，在中胚层生长分化过程中，GATA2起着重要的作用。因此，相对于LSCC，GATA2的功能异常在RSCC中的发生发展可能发挥更重要的作用。
我们之前应用mRNA芯片技术(GEO编码：GSE110204)检测出了在结肠癌组织与癌旁之间存在差异的可编码蛋白质的众多mRNAs。为了筛选更有意义的能编码蛋白质的差异mRNA，将4.5倍差异及-log10P＞5作为截取值，锁定4个候选的mRNAs，分别能编码KLK6，CDH3，CST1及TRIM29。在55对配对的结肠癌及癌旁组织中检测4种蛋白的表达水平，并分析其在LSCC与RSCC中是否存在差异。结果显示，TRIM29在结肠癌组织中较癌旁组织高表达，且在RSCC中表达高于LSCC，确定TRIM29为目的蛋白。为观察TRIM29对结肠癌细胞功能发挥的作用，在结肠癌细胞中敲降TRIM29及过表达TRIM29，通过xCELLigenceRTCAMP系统、Transwell实验及克隆生长实验分别观察TRIM29对功能的影响。分别在10对LSCC及RSCC中检测GATA2的表达水平，表明RSCC较LSCC更为低表达。应用免疫组化方法(Immunohis-tochemistry，IHC)检测相同组织芯片中TRIM29及GATA2的表达水平，分析二者的相关性，结果证实了GATA2与TRIM29存在负相关，并进一步在结肠癌细胞中过表达GATA2，检测TRIM29表达水平的变化，验证了GATA2能够抑制TRIM29的表达。通过双荧光酶报告基因实验，在结肠癌细胞中验证了GATA2转录抑制TRIM29的表达。
应用免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)及质谱分析(Mass spectr-ometry ， MS )的方法检测TRIM29下游的靶基因是丙酮酸激酶1/2(Pyruvate Kinase M1/2，PKM1/2)，敲降TRIM29而导致结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移的能力的减弱是通过作用于PKM1/2而实现的。体内及体外实验证实，TRIM29能够泛素化降解PKM1及PKM2，其中主要降解PKM1，导致PKM1/PKM2的比值下降，PKM1与抑制肿瘤增殖有关，而PKM2在促进肿瘤增殖方面起关键作用。PKM1/PKM2比值决定了葡萄糖分解代谢的方向，文献报道证实结肠癌受能量代谢的调节。本研究利用海马细胞外通量分析仪XF96(Seahorse Bioscience)在体外监测结肠癌细胞细
胞代谢变化，结果证实TRIM29的过表达通过降低PKM1/PKM2比值导致肿瘤细胞糖酵解能力增强，氧化磷酸化能力减弱。本研究共分为四部分内容。
第一部分TRIM29在结肠癌组织中的表达及其在左右半结肠癌中的表达差异
目的：筛选并锁定在结肠癌发生过程中起关键作用，并在LSCC及RSCC患者中差异表达的关键分子。
方法：对之前10对结肠癌与癌旁组织芯片的结果设定截取值进行筛选，并在CCLE数据库中查寻候选蛋白在结肠癌细胞株中的表达情况，确定出在结肠癌发生中扮演重要作用的候选蛋白；应用免疫组化方法检测55对结肠癌与癌旁组织中候选蛋白所表达的蛋白水平，观察是否存在差异，并应用χ2检验进一步按照肿瘤部位进行分析，并应生物信息学分析左右半结肠差异的mRNA，最终锁定TRIM29为在LSCC及RSCC中表达差异的蛋白；应用qPCR检测TRIM29在46对配对的癌及癌旁组织的mRNA表达水平，应用t检验探讨TRIM29-mRNA表达水平在癌与癌旁组织的差异及在LSCC及RSCC中的差异。应用WesternBloting方法检测TRIM29在8对癌及癌旁组织中的表达水平；应用χ2检验分析不同TRIM29表达水平与分期及淋巴结转移的关系；应用Kaplan-Meier方法及Log-rank检验分析不同TRIM29水平间生存率的差异。
结果：
1.与结肠癌发生相关关键mRNA的筛选。芯片(GEO编码：GSE110204)检测出1605条在结肠癌组织中高表达的mRNA及1606条低表达的mRNA。将foldchange＞4.5和-log10P＞5设为截取值，最终锁定4条可编码CDH3、CST1、KLK6及TRIM29的mRNAs作为候选基因；
2.RSCC与LSCC中差异蛋白的确定。应用免疫组织化学染色方法在55对配对的结肠癌组织及癌旁正常组织石蜡切片中检测4个候选基因CDH3、CST1、KLK6及TRIM29的蛋白表达情况。结果发现四种蛋白均在癌组织中有不同程度的升高。将55例患者分为LSCC及RSCC为2组，其中20例为RSCC，35例为LSCC。结果发现，TRIM29在RSCC中的强烈表达(+++)的概率明显高于LSCC(P＜0.001)，其他3种蛋白在两
组中的水平无明显差别。且结合RSCC及LSCC中差异mRNA的生物信息学分析，确定TRIM家族在结肠癌组织中高表达，且在LSCC及RSCC中的表达存在差异，为研究对象。
3.TRIM29在结肠癌组织的mRNA表达水平较癌旁组织升高(P=0.014)，其中RSCC中TRIM29的mRNA表达水平较LSCC升高(P=0.03)。
4.TRIM29高表达与淋巴结转移及更差的分期相关(P分别为0.018，＜0.001)，并与较差的总生存期(Overall survival，OS)有关(P=0.005)。TRIM29低表达组患者OS为24个月，高表达组中位OS为64个月。
第一部分TRIM29对结肠癌细胞生物学行为的影响
目的：探讨TRIM29在体内及体外对结肠癌细胞生物学行为的影响。
方法：构建过表达TRIM29的质粒及敲降TRIM29的SiRNA，在SW480及DLD-1细胞株转染SiRNA敲降TRIM29，在DLD-1及HCT116细胞株转染质粒过表达TRIM29，分别作用48小时后，利用xCELLigenceReal-TimeCellAnalyzer(RTCA)-MP系统观察并统计细胞的增殖能力与对照组的差异；转染48后，进行transwell实验、细胞克隆实验，观察实验组及对照组侵袭迁移及细胞克隆形成细胞数，应用t检验分析实验组及对照组侵袭迁移及克隆的细胞数目是否存在差异。构建敲降TRIM29的稳转细胞株，验证稳转细胞功能，分别在10只裸鼠中左右肩皮下及5对裸鼠尾静脉注射对照空载细胞及稳转敲降细胞，观察皮下移植瘤及形成肝、肺转移瘤的数目，应用t检验分析实验组及对照组皮下移植瘤的重量及转移瘤的数目是否存在差异。
结果：
1.过表达TRIM29后，DLD-1及HCT116细胞的增殖能力较前增强；敲降TRIM29后，SW480及DLD-1细胞的增殖能力较前减弱；
2.转染过表达TRIM29的质粒(TRIM29 GFP)后，DLD-1GFP(空载)及DLD-1TRIM29GFP组迁移至膜下表面的细胞数分别为278±21及376±32；以上两组侵袭至膜下表面的细胞数分别为173±13及282±21。以上各组差异均具有显著统计学意义(P均＜0.001)。在HCT116GFP及HCT116TRIM29GFP组迁移至膜下表面的细胞数分别为149±16及211±15；以上两组侵袭至膜下表面的细胞数分别为158±14及201±17。以
上各组差异均具有显著统计学意义(P均＜0.001)。过表达TRIM29后，细胞的迁移、侵袭能力均有显著提高。
3.在SW480及DLD-1细胞株中应用SiRNA1及SiRNA2敲降TRIM29后，SW480TRIM29NC、SW480TRIM29Si1及SW480TRIM29Si2组迁移至膜下表面的细胞数分别为150±18，82±8及88±9；以上各组侵袭至膜下表面的细胞数分别为16±3，3±1及8±2。DLD-1TRIM29NC、DLD-1TRIM29Si1及DLD-1TRIM29Si2组迁移至膜下表面的细胞数分别为398±29，163±14及143±11，以上各组侵袭至膜下表面的细胞数分别为349±27，133±11及125±9，差异均具有显著统计学意义(P均＜0.001)。敲降TRIM29后，细胞的迁移、侵袭能力均有明显下降。
4.在DLD-1及SW480细胞株分别转染TRIM29NC及TRIM29SiRNA2，HCT116及DLD-1细胞分别转染GFP及TRIM29-GFP质粒，结果显示敲降TRIM29后，SW480NC、SW480SiRNA2、DLD-1NC、DLD-1SiRNA2各组形成细胞克隆的数目分别为103±7、25±3、13±2和3±1，SW480及DLD-1细胞的形成克隆的能力较前减弱(P均＜0.01)；过表达TRIM29后，DLD-1GFP、DLD-1TRIM29-GFP、HCT116GFP、HCT116TRIM29-GFP各组形成细胞克隆的数目分别为6±2，13±4，21±3，58±5，DLD-1及HCT116细胞形成克隆的能力较前增强(P均＜0.01)(图16)。
5.稳转敲降TRIM29的细胞株，其增殖、侵袭迁移及克隆能力均获得与瞬转一致的结果。
6.应用SW480及HT29稳转细胞进行体内实验，两株细胞Lenti-shTRIM29的皮下移植瘤均较Lenti-NC质量明显减轻(P分别＜0.01及P＜0.001)。HT29Lenti-shTRIM29肝转移及肺转移瘤数目均较HT29Lenti-NC组减少。
第三部分TRIM29上游调控机制的研究
目的：探讨并确定TRIM29的上游调控基因。
方法：应用公共数据库查阅TRIM29基因突变及拷贝数变化情况，并查阅文献了解非编码RNA在CRC调控TRIM29的可能性，最终锁定TRIM29受转录因子调控；应用JASPAR软件通过设置截取值匹配并筛选能识别TRIM29启动子的转录因子。查阅文献，选择具有调控生长分化功
能的转录因子，最终锁定GATA2为调控TRIM29的候选转录因子。应用GEPIA软件分析GATA2与TRIM29的相关性。构建过表达GATA2的质粒，过表达GATA2后，应qRT-PCR检测GATA2及TRIM29的mRNA表达水平。在DLD-1细胞株应用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunop-recipitation，ChIP)实验方法及在293T细胞株中应用双荧光素酶报告基因实验方法验证GATA2与TRIM29启动子相结合，并负调控TRIM29的表达。在10对配对的结肠癌与癌旁组织中检测GATA2的蛋白表达水平，观察其在RSCC及LSCC中的表达水平差异。
结果：
1.数据库中显示TRIM29基因突变及拷贝数变化发生的频率均很低，均不到1%；
2.GEPIA公共数据库结果显示GATA2及TRIM29表达存在显著负相关性。(R=-0.3，P＜0.001)；
3.过表达GATA2后，TRIM29的mRNA表达水平明显下降；
4.免疫共沉淀实验结果显示，GATA2抗体能将TRIM29启动子区的Primera、Primerb+c、Primerd三个区域沉淀下来，而对照组IgG抗体不能；
5.双荧光素酶报告基因实验结果证实，过表达GATA2后报告基因的活性被显著抑制。
第四部分TRIM29下游调控机制的研究
目的：寻找并锁定TRIM29的下游基因及具体调控机制
方法：应用免疫沉淀联合质谱的方法寻找TRIM29下游作用的蛋白。通过免疫共沉淀验证出TRIM29可与PKM1/2相互作用。过表达或敲降TRIM29后，应用qRT-PCR检测并应用t检验分析PKMmRNA的变化；应用WesternBloting检测并观察PKM1/2的蛋白表达情况。过表达TRIM29后，加入蛋白合成抑制剂放线菌酮(Cycloheximide，CHX)处理24h，WesternBloting实验观察PKM1/2蛋白稳定性的变化；过表达TRIM29后，加入蛋白酶体抑制剂MG132处理12小时，进行后续的泛素化Co-IP实验及WesternBloting实验观察PKM1/2的泛素化水平。应用免疫组化染色检测3个完全相同组织微阵列的GATA2、TRIM29、PKM1的蛋白表达水平，
应用Kendal’stau-b检验分析GATA2、TRIM29及PKM1蛋白表达的相关性。分别敲降TRIM29、过表达PKM1及PKM2，应用海马细胞外通量分析仪XF96(Seahorse Bioscience)，SeahorseXFGlycolysisStressTestKit(糖酵解压力测试试剂盒)和SeahorseXFCellMitoStressTestKit(线粒体压力测试试剂盒)(安捷伦科技)检测细胞外酸化率(ECAR)和耗氧量(OCR)的变化。应用TRIM29-GFP质粒过表达TRIM29，再分别过表达PKM1或PKM2进行细胞功能回复(Rescue)实验，观察并分析PKM1及PKM2能否逆转TRIM29所致的增殖、侵袭迁移、ECAR及OCR的变化。
结果：
1.免疫沉淀联合质谱分析显示，NT5E、SerpinB3、ANXA2、LDHA和PKM1/2为TRIM29候选下游基因；
2.免疫共沉淀验证出TRIM29能与PKM1/2相互作用；
3.过表达及敲降TRIM29后，PKM1/2的mRNA表达水平无明显变化，但PKM1/2蛋白表达水平降低及升高，PKM1的变化更为明显；
4.过表达TRIM29后，CHX处理24小时后，PKM1/2的蛋白稳定性减低；过表达TRIM29后，加入蛋白酶体抑制剂MG132处理12小时后，能检测到更多的PKM1/PKM2被泛素化标记，且二者相比PKM1这种现象更为明显；
5.GATA2、TRIM29及PKM1蛋白表达呈两两负相关(P值分别为0.023，0.003；Kendal’stau-bR分别为-0.389及-0.516)；
6.过表达PKM1后，细胞的糖酵解能力明显降低、氧化磷酸化能力明显升高，ECAR减低、OCR升高；过表达PKM2后，细胞的糖酵解能力明显升高、而氧化磷酸化能力稍有降低，ECAR升高及OCR降低；
7.在TRIM29-GFP质粒处理的细胞中，OCR、ECAR和细胞的增殖、侵袭、迁移能力能通过PKM1的过表达部分得以挽救，但PKM2的过表达则无法挽救其效应。
结论：
1.TRIM29在结肠癌患者癌组织中的表达显著高于配对癌旁正常组织，TRIM29在结直肠的发生发展中起重要作用；
2.TRIM29能促进结肠癌的恶性行为，且与淋巴结转移及较差的TNM分期及预后有关；
3.TRIM29在RSCC中的表达较LSCC表达升高，提示TRIM29可能做为左右半结肠癌差异的分子标志物；
4.TRIM29受GATA2转录负调控；
5.TRIM29主要泛素化降解PKM1，影响糖代谢而发挥抗肿瘤作用。