以表现皱缩症状的三七叶片为研究对象,通过生物学、血清学、电镜观察及分子生物学方法初步证明表现该种症状的三七中含有包括一种马铃薯Y病毒属病毒在内的至少3种不同病毒。ToMV虽然也曾被检测到,但并不是主要的病原。 通过摩擦接种的方法将发病三七叶片的汁液接种于4科17种指示植物,结果所有供试植株均不表现症状;将发病三七叶片与感染TMV的普通烟,感染ZYMV的小西葫芦叶片分别研磨后按一定比例混合,接种指示植物,结果指示植物症状的严重度与发病三七叶片提取液浓度的高低密切相关。因此,证明三七中含有抑制病毒侵染的物质。 ELISA分析结果表明,除第一次采集的样品与ToMV有血清学关系外,后两次采集的样品与本实验室保存的14属29种抗血清均没有血清学关系。 对第一次采集的样品提取总RNA,用特异性引物进行RT-PCR,得到了ToMV3′端部分序列。对后两次采集的样品提取dsRNA,结果提到4条大小不等的dsRNA,以dsRNA为模板,进行反转录,最终得到了病毒双链cDNA的随机片段库。随机挑选12个克隆测序,序列分析结果表明,12个克隆中有3个克隆的序列与Potyvirus病毒有较高同源性,可以确定为该属病毒;另9个克隆分别与水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged dwarf virus)、啤酒酵母L-A病毒(Saccharomyces cerevisiae virus L-A)、姬菇球形病毒(Oyster mushroom isometric virus)有一定的同源性,可能为其中的一种或几种,其分类地位有待于进一步研究确定。 提取发病三七叶片的总DNA然后用特异性引物进行扩增,没有检测到植原体的存在。提取总RNA进行双向SDS-PAGE,没有检测到类病毒的存在。 采用RT-PCR方法自扩增出小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)的CP基因,连接到原核表达载体pET-22b(+)上,获得的重组子pET-ZCP转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,融合蛋白分子量约为33.0 kD。将融合蛋白纯化后免疫兔子,获得了特异性较高的抗血清。酶联法测定该抗血清效价为1/4096。