糖尿病神经痛(DNP)严重影响2型糖尿病人的生活质量,然而,DNP的分子机制仍然未明。新近的研究认为在一些神经痛模型中有脊髓神经胶质细胞的参与。然而,2型糖尿病中脊髓神经胶质细胞是否激活并导致糖尿病性神经痛仍不明确。本研究中,db/db小鼠的2型糖尿病模型,可以表现出明显的机械痛敏,我们发现脊髓星形胶质细胞而不是小胶质细胞有明显活化。且鞘内注射LAA(星形胶质细胞特异性抑制剂)可以明显缓解机械痛敏,而小胶质细胞特异性抑制剂米诺环素则未见明显影响,这说明脊髓星形胶质细胞活化与db/db小鼠的机械痛敏有关。进一步的研究确定星形胶质细胞诱导db/db小鼠机械痛敏的机制,结果表明脊髓星形细胞的活化大大增加了IL-1β的表达,并诱导脊髓背侧角神经元N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR)磷酸化而增强痛觉传导。同时这些结果表明脊髓活化的星形胶质细胞可能是2型糖尿病机械痛敏的重要病因,且“星形胶质细胞-IL-1β-NMDAR-神经元”通路可能是星形细胞诱发机械痛敏的具体机制。所以,抑制脊髓背侧角星形胶质细胞活化可能成为新的DNP治疗手段。目的:糖尿病病人中约有50%会发生糖尿病神经病变,其中半数的病人会有DNP的症状,DNP是糖尿病神经病变的严重并发症之一。随着2型糖尿病的发病率越来越高,DNP等糖尿病并发症的发病率和死亡率也越来越高。目前对于DNP尚无特效的治疗手段,并且对阿片类传统镇痛药耐受。目前的常用治疗药物作用很有限,且副作用大,这种情形下2型糖尿病动物模型的DNP机制研究显得很有必要。本实验以2型糖尿病小鼠为模型,旨在研究其机械痛敏的发生机制,为DNP的治疗寻找新的突破点。方法:1.小鼠被分成C57组、db/+组、db/db组和db/db+PBN(1.5 mg/kg/day,腹腔注射)组。在出生后的不同时间点(每周),测定血糖、体重和机械痛阈。出生后每周行GFAP免疫染色,麻醉后用多聚甲醛灌注取脊柱L4–L5段切成20μm薄片,然后用相应抗体孵育。生后每周行western blot,每组小鼠麻醉后迅速截取脊柱L4–L5段,匀浆后离心,上清用于Western blot分析GFAP, OX42, IL-1β或P-NR1。2. db/db小鼠生后10周机械痛敏达最严重时放置鞘内导管,导管长度2cm,死腔容积0.5μl。导管放置速度很快,氟烷麻醉后,颈后小切口,小脑延髓池环枕膜穿刺,导管即置于鞘内,导管用1μl生理盐水灌注,缝合切口。虽然仅需5分钟来完成上述过程,但颈后和环枕膜有创伤,所以小鼠在实验前有3天的恢复期,然后,生理盐水,LAA或米诺环素溶于3μl生理盐水行鞘内注射。鞘内药物注射后,即开始进行疼痛阈值的测试(n=10/组)。3.使用10周龄的db/db小鼠,在放置鞘内导管后,小鼠恢复3天后开始实验。第一、生理盐水、IL-1受体拮抗剂和己酮可可碱溶于3μl生理盐水并行鞘内注射,即开始进行疼痛阈值的测试(n=10/组)。第二、LAA溶于3μl生理盐水鞘内注射,1小时候取新鲜脊索组织对IL-1β进行Western blot分析(n=10)。第三、多聚甲醛灌注后截取脊柱L4–L5段切成薄片,进行GFAP和IL-1β的免疫荧光双标实验。4.第四部分实验:10周龄的db/db小鼠,置入鞘内导管恢复3天后,首先用LAA、己酮可可碱或IL-1受体拮抗剂溶于3μl生理盐水并鞘内注射1h后取新鲜脊柱组织行P-NR1的Western blot分析(n=10/组)。然后,多聚甲醛关注后截取L4–L5脊柱组织切片,行IL-1RI和P-NR1的免疫荧光双标实验。结果:1. 2型糖尿病小鼠的机械痛敏:观测db/db, db/+和C57小鼠生后4周到20周的血糖和体重以监测2型糖尿病模型的情况(n=10/组)。db/+组(5.6±0.8mmol/L; P6)和C57组(5.9±0.7mmol/L; P6)之间的血糖无明显差异,并且这两组的血糖在整个实验过程中均保持正常水平。相比较于db/+组和C57组小鼠,db/db组小鼠的血糖于出生后6周开始明显升高(16.2±2.8mmol/L),在第8周达到峰值(26.4±5.6mmol/L),随后一直保持高血糖水平(P<0.05)。db/db小鼠的体重在出生后第四周明显增加(26±5.2g),并且一直持续增长,第16周时,db/db组小鼠的体重(65±7.2g)几乎达到db/+组(30±3.6g)和C57组(33±2.9g)的两倍(P<0.05)。爪收缩阈值db/+组(20±1.6g; P6)和C57组(20±1.1g; P6)无明显差异,且两组疼爪收缩阈值一直保持正常水平。db/db组爪收缩阈值(12.3±2.8g;P6)显著偏低,表明对机械刺激敏感性增强,机械痛敏峰值在(7.4±1.9g;P8)并一直持续(P<0.05)。因此,这些数据表明db/db组小鼠2型糖尿病模型正常,并表现出与高血糖一致的机械痛敏。2.糖尿病氧化应激诱使星形细胞活化并诱发机械痛敏:为了验证神经胶质细胞激活诱发db/db组小鼠机械痛敏的假设,我们对三个组的小鼠进行了星形胶质细胞标记物GFAP和小胶质细胞标记物OX42的观察研究(n=10/组/周)。免疫组织化学染色显示第8周时,相较于db/组+和C57组,db/db组小鼠脊柱GFAP染色明显升高,并一直持续。这种增强染色集中于背侧角表面。激活的星形胶质细胞体积变大并增多,伴有GFAP免疫活性增强。应用Western blot,我们检测到GFAP表达在db/+组小鼠(0.55±0.07;P6)和C57组小鼠(0.53±0.08; P6)之间没有明显差异,在整个实验过程中,两组的GFAP表达也处于同一水平。但db/db组小鼠的GFAP表达水平明显高于另外两组(1.7±0.3;P6) (P<0.05)。GFAP表达在第8周时达峰值(2.0±0.35)并一直持续,这和机械痛敏的变化过程一致。而生后每周的免疫组化和Western blot均未发现OX42在三组小鼠中的表达有明显差异。在整个实验中,各组小鼠的OX42表达均未有明显变化。我们鞘内注射LAA或米诺环素并观察其对db/db组小鼠机械痛敏的效应。星形胶质细胞特异性抑制剂LAA显著的减轻了机械痛敏,然而,小神经胶质细胞的特异性抑制剂米诺环素对机械痛敏无明显影响。另外,全身应用PBN(活性氧自由基清除剂)可以显著减少GFAP的表达,这表明糖尿病诱发的氧化应激可能介导了db/db组小鼠星形胶质细胞的激活。3.脊柱星形胶质细胞显著增加了IL-1β表达并和机械痛敏有关:Western blot分析表明db/+组(0.028±0.007; P6)和C57组(0.022±0.005; P6)的IL-1β表达无明显差异,并且在整个实验过程中也保持同样水平。然而db/db组的IL-1β表达水平明显高于另外两组(0.13±0.03;P6) (P<0.05)。IL-1β表达在第八周达到峰值(0.2±0.04),并一直持续,这与GFAP的表达情况一致,第10周时,db/db组鞘内注射己酮可可碱(细胞因子抑制剂)或IL-1ra(白介素-1受体拮抗剂)并观察其对机械痛敏的影响。己酮可可碱和IL-1ra均可显著减轻疼痛。db/db组小鼠在第十周时,鞘内注射LAA可以下调IL-1β的表达,随后的荧光双标染色显示IL-1β免疫反应区位于GFAP免疫阳性细胞内。4. IL-1β诱导脊髓背侧角神经元NMDA受体磷酸化:Western blot分析显示脊髓NMDA受体亚基P-NR1表达在db/+组(0.04±0.01; P6)和C57组(0.043±0.012; P6)间无明显差异,且P-NR1表达水平在一直没有明显变化。然而,相较于db/+组和组,db/db组的P-NR1表达水平明显升高(0.38±0.06;P6) (P<0.05),并且一直持续这个水平,这与IL-1β和GFAP的表达情况相似。db/db组在第10周是,鞘内注射LAA,己酮可可碱或IL-1ra可以显著下调P-NR1的表达。随后的免疫荧光双标染色显示P-NR1免疫阳性和IL-1RI免疫阳性区是完全重合的。结论:我们首次提供了证据表明脊髓星形胶质细胞活化与2型糖尿病db/db小鼠机械痛敏的发生有关。星形细胞活化诱导机械痛敏的详细机制可能是脊髓活化的星形细胞显著曾加了IL-1β的表达,后者再诱导脊髓背侧角神经元NMDA受体磷酸化,增强神经元活栋和疼痛传导。IL-1β不仅仅是被动的作为星形细胞活化后的产物,而且可以进一步增强神经元活动。因此,2型糖尿病中脊髓星形细胞和IL-1β信号在中枢神经系统兴奋性增强中有重要作用。这些发现将帮助我们确定一个潜在的新的治疗糖尿病神经痛的靶点。