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【目的】通过在体动物实验和体外细胞实验,研究中药复方芪归糖痛宁颗粒对糖尿病大鼠坐骨神经脱髓鞘病变的干预作用,并基于micro RNA-155-5p调控的PI3K/Akt/m TOR自噬信号通路探讨芪归糖痛宁对高糖培养的髓鞘雪旺细胞自噬及凋亡的干预作用及机制。【方法】1.在体动物实验采用50只SPF级成年GK大鼠高脂饲料喂养的方式建立糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)模型,另设10只正常wistar大鼠作为正常组进行对照。饲养8周后以两次随机血糖≥16.7mmol/L作为筛选标准,按血糖和体重随机数字表法进行分组将GK大鼠分为模型组(MC),中药低剂量组(QGT-L,2.25g/kg·d),中药中剂量组(QGT-M,4.5g/kg·d),中药高剂量组(QGT-H,9.0g/kg·d),甲钴胺组(MEC,0.225mg/kg·d),每组10只,连续给药干预6周。正常组和模型组给予等量生理盐水。实验过程中记录大鼠一般情况,记录每周随机血糖,于第6周取材前进行神经生理功能检测,包括感觉、运动神经传导速度检测(SCV,MCV)和热敏、痛敏反应时间检测。麻醉后取坐骨神经组织,进行病理HE染色;免疫组化检测神经髓鞘分泌因子Neuritin和Lipin-1的表达;电镜下观察亚细胞形态结构;western bolt免疫印迹检测beclin1,LC3Ⅱ/Ⅰ,PI3K,p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR的相对表达量;PCR检测mi RNA-155-5p,PI3K,Akt和m TOR的m RNA表达。2.体外细胞实验实验一:采用高糖培养雪旺细胞(SCs细胞)的方法模拟DPN的髓鞘损伤体外模型,大鼠RSC96雪旺细胞株传代3-5代,wistar大鼠灌胃3天用以配置芪归糖痛宁含药血清。设立正常血清培养组,高糖培养组,芪归糖痛宁含药血清低(5%)、中(10%)、高(20%)含量组,通过CCK-8法检测各组细胞的增值率,免疫荧光实验检测beclin-1的表达,PCR检测mi RNA-155-5p的表达。通过生信网站预测mi RNA-155-5p作用于PI3K/Akt/m TOR通路的靶基因,再建立野生型和突变型的靶基因载体和mi RNA-155-5p共转染入雪旺细胞,进行荧光素酶报告实验。实验二:通过构建mi RNA-155-5p过表达mimics,抑制表达inhibitor以及对应的mimics-NC和inhibitor-NC质粒,将雪旺细胞按正常血清培养组(NC);高糖培养组(MC);mi RNA-155-mimics组(mi R-mimics);mi RNA-155-inhibitor组(mi R-inhibitor);芪归糖痛宁组(20%含药血清);mi RNA-155-mimics-NC组(mi R-mimics-NC);mi RNA-155-inhibitor-NC组(mi R-inhibitor-NC)进行分组。采用PCR检测mi RNA-155-5p,PI3K和ATG5,ATG12自噬标记基因的表达;western blot检测PI3K,p-Akt/Akt,p-m TOR/m TOR和LC3II/I的相对表达量;免疫荧光检测beclin-1,P62的表达。流式细胞术检测各组细胞的凋亡水平。实验三:1.自噬机制验证:在芪归糖痛宁组细胞中转染mi RNA-155-inhibitor,并沿用实验二的方法将雪旺细胞依次分为高糖组,mi R-inhibitor组,芪归糖痛宁组和芪归糖痛宁+mi R-inhibitor组。免疫荧光检测各组细胞的beclin-1表达,western blot检测p-Akt/Akt,p-m TOR/m TOR的表达量。2.凋亡机制验证:采用添加自噬截断剂3-MA阻断自噬的方法,将细胞分为高糖组;高糖+3MA组;芪归糖痛宁组;芪归糖痛宁+3MA组。用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。【结果】1.在体动物实验一般情况观察显示,模型组大鼠出现多食、多饮、多尿症状,伴有消瘦,精神萎靡,而芪归糖痛宁低、中、高剂量组症状均有改善。血糖监测结果显示,芪归糖痛宁低、中、高剂量组的血糖相比模型组降低(P<0.01)并均呈下降趋势,从第3周开始,高剂量组的降糖效果开始明显优于低于低剂量组。神经生理功能检测显示,模型组大鼠相比正常组SCV和MCV明显减慢(P<0.01),热敏和痛敏反应时间延长(P<0.01);芪归糖痛宁低、中、高剂量组相比模型组SCV和MCV升高(P<0.01),热敏反应时间和痛敏反应时间缩短(P<0.01);其中高剂量组和甲钴胺组对SCV、MCV、热敏反应时间和痛敏反应时间的作用均优于低剂量组。形态学观察显示,光镜下HE染色的模型组出现髓鞘破损溶解,电镜下观察可见线粒体肿胀,内质网破裂,部分细胞可观察到凋亡小体。而芪归糖痛宁低、中、高剂量组相比模型组脱髓鞘病变明显减轻,电镜下细胞器损伤减轻,高剂量组可见一定数量的自噬体和自噬囊泡。免疫组化显示模型组相比正常组Neuritin,Lipin-1表达下降(P<0.01),芪归糖痛宁低、中、高剂量组相比模型组的表达增多(P<0.05,P<0.01),呈剂量依赖性。Western-blot检测显示模型组相比正常组beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达量显著下降(P<0.01),PI3K,p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR的表达量升高(P<0.01);芪归糖痛宁低、中、高剂量组相比模型组beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ的相对表达量升高(P<0.01);PI3K,p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR的相对表达量下降(P<0.01),其中高剂量组的beclin1,LC3Ⅱ/Ⅰ,PI3K和p-m TOR/m TOR的指标变化较低剂量组更显著。PCR检测显示模型组相比正常组的mi R-155-5p表达下降,PI3K,Akt和m TOR的m RNA表达升高(P<0.01);相比模型组,芪归糖痛宁低、中、高剂量组mi R-155-5p的表达升高(P<0.01),PI3K,Akt和m TOR的m RNA表达下降(P<0.01);其中高剂量组对于mi R-155-5p和PI3K的m RNA的表达影响比低剂量组更显著。2.体外细胞实验实验一:CCK-8实验显示高糖组的雪旺细胞相比正常组增值率下降,而芪归糖痛宁低、中、高剂量组相比模型组增值率升高(P<0.01),呈剂量依赖性。免疫荧光检测显示,高糖组的雪旺细胞Beclin1表达比正常组显著下降(P<0.01),芪归糖痛宁低、中、高剂量组的Beclin1表达升高(P<0.01),中、高剂量组的作用优于低剂量组。PCR结果显示模型组相比正常组mi RNA-155-5p的表达下降,芪归糖痛宁低、中、高剂量组的表达升高(P<0.05,P<0.01)。荧光素酶报告基因实验显示,在雪旺细胞中,mi RNA-155-5p与靶基因PI3KCA有直接的结合作用并抑制PI3KCA的表达。实验二:PCR结果显示,高糖组相比正常组mi RNA-155-5p,ATG5,ATG12的表达下降,PI3K表达升高(P<0.01);相比高糖组,芪归糖痛宁组的mi RNA-155-5p,ATG5,ATG12升高,PI3K的m RNA表达下降(P<0.05,P<0.01);mi R-mimics组相比mi R-mimics-NC组mi RNA-155-5p,ATG5,ATG12表达升高,PI3K表达下降(P<0.05,P<0.01);mi R-inhibitor组相比mi R-inhibitor-NC组mi RNA-155-5p,ATG5,ATG12表达下降,PI3K表达升高(P<0.05,P<0.01)。Western blot显示,高糖组相比正常组的PI3K,p-AKT/Akt和p-m TOR/m TOR的相对表达量升高,LC3II/I的相对表达量下降(P<0.01);与高糖组相比,芪归糖痛宁组的PI3K,p-AKT/Akt和p-m TOR/m TOR的相对表达量降低,LC3II/I的相对表达量升高(P<0.05,P<0.01);mi R-mimics组相比mi R-mimics-NC组PI3K,p-AKT/Akt和p-m TOR/m TOR的相对表达量降低,LC3II/I的相对表达量升高(P<0.05,P<0.01);mi R-inhibitor组相比mi R-inhibitor-NC组PI3K,p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR的相对表达量升高,LC3II/I的相对表达量下降(P<0.05,P<0.01)。免疫荧光显示,高糖组相比正常组P62的表达量增多,beclin-1的表达下降(P<0.01);与高糖组相比芪归糖痛宁组的P62的表达减少,beclin-1的表达增加(P<0.05);mi R-mimics组相比mi R-mimics-NC组的P62的表达减少,beclin-1的表达增加(P<0.05);mi R-inhibitor组相比mi R-inhibitor-NC组P62的表达量增多,beclin-1的表达下降(P<0.05)。流式细胞术检测显示高糖组SCs细胞总凋亡率相比正常组显著升高(P<0.01);芪归糖痛宁组相比高糖组凋亡率降低(P<0.01);mi R-mimics组相比mi R-mimics-NC组细胞凋亡率降低(P<0.01);mi R-inhibitor组相比mi R-inhibitor-NC组细胞凋亡率升高(P<0.01)。实验三:1.自噬机制验证:与高糖组相比,mi R-inhibitor组beclin-1表达下降,p-Akt/Akt,p-m TOR/m TOR表达增升高(P<0.05,P<0.01),芪归糖痛宁组beclin-1表达升高,p-Akt/Akt,p-m TOR/m TOR表达下降(P<0.01);芪归糖痛宁+mi R-inhibitor组与芪归糖痛宁组相比p-Akt/Akt,p-m TOR/m TOR表达升高,beclin-1表达下降(P<0.05,P<0.01)。2.凋亡机制验证:与高糖组比较,高糖+3MA组细胞凋亡率升高(P<0.05),芪归糖痛宁组细胞凋亡率下降(P<0.01);芪归糖痛宁+3MA组与芪归糖痛宁组相比凋亡率明显升高(P<0.01)。【结论】1.芪归糖痛宁能够缓解DPN大鼠坐骨神经脱髓鞘病变,促进神经营养因子的分泌,并具有促进神经生理功能恢复的功效。2.在雪旺细胞中,mi RNA-155-5p通过抑制靶基因PI3KCA,进而对PI3K/Akt/m TOR信号通路的激活产生抑制作用。3.芪归糖痛宁能够能够促进高糖环境下的雪旺细胞的增殖活性,并通过上调mi RNA-155-5p的表达靶向抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路,进而促进雪旺细胞自噬。其中mi RNA-155-5p可能是芪归糖痛宁调节雪旺细胞自噬的重要靶点。4.芪归糖痛宁具有减轻高糖环境下雪旺细胞凋亡的作用。其中上调细胞自噬活性可能是芪归糖痛宁减轻雪旺细胞凋亡,进而减轻DPN脱髓鞘病变的重要途径。