慢性肾小球肾炎(Chronic glomerulonephritis, CGN)是由多种原因引起的免疫炎症性疾病,其发病隐匿,病因复杂,发病机制至今尚未完全明确。近年来,miRNAs作为是一类内源性、小分子非编码RNA,广泛参与各类肾脏疾病发生、发展,有望进一步解释CGN发病的分子机制。白介素10 (Interleukin-10, IL-10)是一种多细胞来源、功能多样的炎症与免疫抑制细胞因子,参与机体免疫炎性反应。在肾脏中,IL-10由肾小球系膜细胞和内皮细胞生成和分泌,参与调控正常肾生理功能,也在肾脏疾病中的细胞、分子间信号通路起着重要的转导作用。越来越多研究证实,IL-10与miRNA之间存在直接或间接的相互影响作用,共同参与机体肾脏疾病过程中免疫应答调控。中医药在慢性肾炎领域的预防和治疗具有明显的潜力和优势,真武汤作为温阳利水名方,临床和实验都证实其对慢性肾炎疗效确切,但慢性肾炎本身发病机制复杂,随着研究的深入,一些新的发病机制被不断得到阐明：另外,由于中药复方的作用多靶点性,机制复杂,尚需不断扩展真武汤对慢性肾炎的药理机制,为临床应用提供更多的实验依据。目的：1.制备阳离子化小牛血清蛋白(C-BSA)所致CGN大鼠动物模型,应用真武汤给药治疗干预,从尿蛋白量、肾功能、肾病理形态学改变、血清炎性因子含量和肾组织炎性因子的表达水平等指标评价真武汤对CGN大鼠肾功能、病理和免疫炎症的改善作用。2.利用miRNA微阵列芯片筛选正常和CGN大鼠差异表达的miRNAs,并用实时荧光定量PCR验证芯片结果可靠性。在miRNA差异表达谱中找出在大鼠肾系膜细胞上有高表达的miRNA,预测其调控的靶基因,进行下一步功能研究。3.培养大鼠肾小球系膜细胞(MC),利用脂多糖(LPS)刺激诱导MC建立炎性增殖模型。利用真武汤含药血清干预,考察真武汤含药血清对MC的增殖、生长周期和凋亡的影响,揭示真武汤对MC的增殖、凋亡的影响。4.对MC转染miR-145-5p的mimic和inhibitor,检测miR-145-5p和IL-10 mRNA的表达变化,揭示两者之间的关系。同时研究IL-10介导的PI3K/AKT信号通路的变化情况,在IL-10/AKT通路水平上进行miR-145-5p功能研究。方法：1.取SD大鼠,腹腔注射C-BSA对大鼠预免疫两周后,连续4周尾静脉注射C-BSA诱导CGN大鼠动物模型。自造模开始第4周起,给予真武汤低、高剂量(4.2g/kg、 8.4g/kg),连续灌胃4周。以大鼠尿蛋白、血肌酐、尿素氮和肾脏病理形态学等指标评价真武汤对CGN大鼠肾功能的保护作用。以巨噬细胞侵染肾小球、血清中IL-10.IL-1α和IL-2含量、肾组织中IL-10、TNF-α、IL-2和IL-6 mRNA的表达水平等指标考察真武汤对CGN大鼠免疫炎症的改善作用。2.取正常组和CGN模型组大鼠肾组织各3例,经miRNA标记后,进行miRNA芯片杂交。应用GenePix Pro 6.0读取芯片扫描图像,并提取探针的信号值,根据信号值筛选两组样品间的差异表达miRNA.选取模型组上调表达的miR-145-5p和下调表达的miR-153-3p进行实时荧光定量PCR验证。3.应用脂多糖(LPS, 10μg/mL)刺激诱导MC炎性增殖模型,并用真武汤含药血清进行干预。应用MTT和CCK8法测定真武汤对MC增殖的影响；PI染色后流式细胞术测定真武汤对MC周期的影响；Anexin V/FITC测定各组MC凋亡情况。4.对MC进行miR-145-5p mimic (50nM)、inhibitor (100nM)转染,转染24h后,应用LPS (10μg/mL)刺激MC炎症反应,并用真武汤含药血清进行干预。实时荧光定量PCR检测miR-145-5p、IL-10 mRNA的表达水平；蛋白印迹法(Western Blot)检测AKT、GSK-3α、GSK-3β、p65蛋白的磷酸化和p65、Cyclin D1总蛋白水平,评价miR-145-5p和真武汤对MC增殖的影响以及PI3K/AKT/GSK信号通路和NF-KappaB的影响。结果：1.与模型组相比,真武汤可增加大鼠尿液排出、降低24h尿蛋白；降低血肌酐和尿素含量,保护肾功能；真武汤可以减轻肾小球炎性细胞浸润和肾小球肥大、肾小管上皮细胞的颗粒样变性,抑制系膜基质增殖,改善肾病理病变。真武汤可通过增加抗炎因子IL-10合成分泌,减少促炎因子IL-1α、IL-2、 IL-6、TNF-α,抑制CGN大鼠的免疫炎症反应,继而减轻肾脏免疫损伤。2.比较分析正常和CGN大鼠肾组织的miRNA差异表达谱,共筛选出差异表达miRA (fold change> 2.0)共有26个,其中模型组显著上调miRNA有3个,23种miRNA表达下调,提示miRNA在CGN的发病与发展发挥着重要作用。实时荧光定量PCR结果显示,与正常组比较,模型组肾组织miR-145-5p表达上调2.96倍,miR-153-3p下调2.65倍,与芯片结果趋势一致,证明芯片结果可靠性高。3.与LPS模型组比较,真武汤可以明显抑制MC的增殖,将MC有丝分裂抑制于G0期,但对MC的凋亡没有明显影响。4.与模型组比较,miR-145-5p和真武汤都可以抑制LPS所致的MC增殖异常、促进IL-10 mRNA的表达；还可以抑制AKT、GSK-3α、GSK-3β、p65蛋白的磷酸化,降低Cyclin D1总蛋白表达水平。结论：1.真武汤可以通过增加CGN大鼠尿量、降低24h尿蛋白保护肾功能,减轻大鼠肾脏病理改变,抑制肾小球免疫炎症反应,减轻免疫应答损伤。2.在CGN大鼠中有26个差异表达的miRNA参与CGN的发病与发展,其中miR-145-5p与真武汤在LPS刺激系膜细胞产生炎症应答中起重要调控作用相似,均可以上调IL-10的表达,通过抑制PI3K/AKT/GSK信号通路参与炎症因子分泌的负反馈调节。3.miR-145-5p和真武汤还可以通过降低Cyclin D1的表达,抑制MC的异常增殖；抑制NF-KappaB的活化,调控肾脏免疫炎症反应。