目的：神经胶质瘤是人类最常见的脑部肿瘤，约占脑部肿瘤的40.49％，已成为15岁以下儿童肿瘤致死的第二大病因，是导致35～54岁成年男性和15～34岁女性肿瘤死亡的第四大病因。　　 当前，传统的手术切除，并辅助以化疗，放疗等手段依然是主要的治疗措施。但目前这些常规治疗手段治疗困难、远期效果差、易复发且死亡率高。近年来，随着分子生物学、分子遗传学的研究进展，肿瘤在免疫基因治疗方面取得了长足的进步。这为恶性胶质瘤的有效治疗、提高病人的生活质量、延长生存时间提供了新途径。　　 白细胞介素24(Interleukin24，IL-24)，是由黑素瘤分化相关基因-7(melanomadifferentiation-associatedgene-7，mda-7)编码的一种分泌蛋白，属于细胞因子白介素10家族的新成员。MDA-7是利用减数杂交技术，在β干扰素(Interferonβ，IFN-β)和蛋白激酶C(PKC)激活剂（瑞香素）诱导分化人恶性黑色素瘤细胞HO-1时分离纯化的新基因。最初被命名为MDA-7基因，之后又被命名为MDA-7/IL-24基因或IL-24基因。进一步研究表明，IL-24抗肿瘤活性的机制是诱导细胞凋亡。更加引人注目的是，利用腺病毒介导的IL-24基因，对肿瘤细胞有特异性杀伤作用，而对正常细胞无损害。　　 许多研究表明，IL-24可以通过不同的方式抑制多种肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡，而且具有抑制肿瘤血管形成、增强肿瘤细胞对放疗的敏感性作用，并可通过抑制相关基因的表达降低恶性肿瘤的侵袭和转移。但是目前，关于IL-24对胶质瘤作用的研究报道尚少，尤其对于外源性IL-24基因诱导胶质瘤细胞凋亡的分子机制尚缺乏足够的了解。　　 本研究以转入外源性IL-24基因的C6/IL-24细胞、空载体C6/pLXSN细胞，以及亲代C6细胞为研究对象，应用MTT、Hoechst33258荧光染色、透射电镜等技术，体外观察IL-24对胶质瘤细胞增长的抑制作用。同时，应用Westernblot、流式细胞术、免疫细胞化学的方法检测c-Jun氨基末端蛋白激酶（c-JunNH2-terminalkinases，JNK）和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白的表达变化情况。以进一步探讨IL-24抑制胶质瘤细胞增殖的相关机制。方法：　　 1.细胞培养　　 C6/IL-24、C6/pLXSN和C6细胞均以RPMI1640培养基培养，内含10％胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml。置饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱培养。　　 2.MTT法检测细胞体外增殖活性取对数生长期C6/IL-24、C6/pLXSN和C6细胞各200ul细胞悬液，以1.5×104/ml细胞浓度接种于96孔培养板，37℃，5％CO2培养箱培养6天。每日检测细胞生长情况。每孔加入5mg/mlMTT20μl，继续孵育4小时，离心吸去上清，每孔加入150μlDMSO。用酶标仪测490nm波长吸光值(A值)，每个样品设3复孔，取其平均值并绘制细胞生长曲线。本实验重复3次。　　 3.Hochest33258荧光染色观察细胞核形态改变分别收集生长48h后的C6/IL-24、C6/pLXSN和C6细胞。将细胞用PBS洗后重悬，加入Hochest33258荧光试剂0.5ml，吹打混匀，滴至载玻片上，加盖玻片。置荧光显微镜下观察细胞核的形态学变化。　　 4.透射电镜(TEM)观察C6/IL-24、C6/pLXSN和C6细胞超微结构的变化取对数生长期C6/IL-24、C6/pLXSN和C6细胞，经4％的戊二醛固定，常规制作透射电镜的超薄切片，在电镜下观察C6/IL-24细胞的超微结构的改变。　　 5.流式细胞术检测JNK和caspase-3蛋白的表达收集对数生长期细胞，70％乙醇4℃固定细胞24h，加入兔抗大鼠的JNK和caspase-3的一抗孵育30分钟。之后，加入山羊抗兔的FITC-IgG二抗工作液，在避光条件下孵育30分钟。再用50μg/mlPI染色30min。最后，用流式细胞仪测定JNK和.caspase-3蛋白的表达。　　 6.免疫细胞化学检测JNK和caspase-3蛋白表达将对数生长期C6/IL-24、C6/pLXSN和C6细胞，接种于预先置有无菌盖片的6孔培养板中，待细胞爬满盖片后，用4％多聚甲醛固定10min，3％过氧化氢处理10min。0.3％TritonX-100处理10min、10％正常羊血清处理15min;兔抗大鼠Bcl-2一抗4℃温育过夜。用PBS代替一抗作为阴性对照。羊抗兔生物素标记的二抗37℃温育40min;过氧化物酶标记链霉卵白素37℃温育40min，0.05％DAB显色、梯度酒精脱水、二甲苯透明、封片、显微镜观察照相。　　 7.Westernblot检测JNK和caspase-3蛋白的表达收集C6/IL-24、C6/pLXSN和C6细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量-→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜转移→5％脱脂奶粉封闭，室温1.5～2h→结合兔抗大鼠的一抗4℃过夜→TBS-T(含0.05％Tween20的TBS)洗3次，5～10min/次-→HRP-标记的羊抗兔IgG室温反应1～2h→TBS-T洗3次，5～10min/次→ECL显影，照相并用凝胶图像分析系统测定各蛋白条带的积分光密度，并以与β-actin的比值计算目的蛋白表达。　　 8.统计学方法实验结果以(?)±s表示，用SPSS13.0统计软件作单因素方差分析(One-WayANOVA)，以P＜0.05为有显著性意义。　　 结果：　　 1.MTT分析C6/IL-24细胞体外增殖情况C6/IL-24细胞与C6/pLXSN和亲代C6细胞相比，其吸光值降低，细胞生长曲线显示其体外增殖能力降低。　　 2.Hochest33258染色观察细胞核形态变化C6/IL-24细胞凋亡后出现细胞核变形、核固缩或碎裂状改变。　　 3.透射电镜(TEM)观察细胞的超微结构的变化结果显示，与C6/pLXSN和C6细胞相比，C6/IL-24细胞超微结构出现细胞核固缩、染色质边集等凋亡的形态学改变。　　 4.流式细胞术检测JNK和caspase-3蛋白的表达与C6/pLXSN和C6细胞相比，C6/IL-24细胞的JNK和caspase-3蛋白表达增高（P＜0.05）。　　 5.免疫细胞化学检测JNK和caspase-3蛋白的表达JNK和caspase-3免疫阳性染色多位于细胞浆内。C6/IL-24细胞的免疫阳性细胞较多，染色较深，呈棕黄色。C6和C6/pLXSN细胞的免疫阳性细胞较少，染色较浅。与C6和C6/pLXSN细胞比较，C6/IL-24细胞的JNK和caspase-3蛋白表达增高。　　 6.Westernblot分析JNK和caspase-3蛋白的表达C6/IL-24、C6/pLXSN及亲代C6细胞JNK蛋白IOD比值分别为2.63±0.04、1.34±0.05和1.30±0.04;caspase-3蛋白为2.68±0.05、1.59±0.08和1.60±0.09。结果显示：与C6/pLXSN及C6细胞比较，C6/IL-24细胞的JNK和caspase-3蛋白表达增高(P＜0.05）。C6/pLXSN与C6细胞比较无显著性差异(P＞0.05)。结论：　　 1外源性IL-24基因可抑制C6胶质瘤细胞的增殖。　　 2外源性IL-24基因可通过上调caspase-3的表达诱导6胶质瘤细胞凋亡。　　 3外源性IL-24基因对胶质瘤细胞诱导凋亡作用，与其上调并激活JNK表达有关。