研究背景:肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是临床最为常见的胃肠功能性疾病之一,世界各国流行率从1.1%-35.5%不等,其中亚洲为9.6%。由于我国人口众多,是世界上IBS患者最多的国家之一,防治任务非常艰巨。根据罗马IV标准,IBS可分为腹泻型(IBS-D)、便秘型(IBS-C)、不定型(IBS-U)、混合型(IBS-M)四种亚型。由于IBS的病因和发病机理尚不甚明确,临床上缺乏有效的防治手段,因此严重影响患者的学习、工作和生活,给患者带来极大的精神和经济负担。所以,IBS不仅仅是个临床问题,更是一个亟需解决的社会问题。研究表明IBS可能是胃肠黏膜屏障功能障碍、胃肠动力异常、内脏高敏感、肠道黏膜炎症后、神经内分泌失调、肠道食物过敏和精神心理异常等多种因素相互影响的结果,然而其病理生理基础、特别是分子机制仍然不明。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)主要分布于肠黏膜中,介导水液跨膜转运,对于维持肠道细胞内外环境的稳定、调节肠道水分子的吸收和分泌以及改善肠道神经功能等方面具有重要的作用。尽管目前有关AQPs水液代谢机制的研究并不鲜见,但其在IBS发病中的作用和机制仍然不甚清楚,有待进一步研究。目前有关miRNA以及肠黏膜通透性与IBS的相关研究已成为热点,但鲜有miRNA与水通道蛋白关联方面的研究。为进一步探寻IBS-D肠黏膜水通道蛋白的变化及其分子机制研究,本研究建立IBS-D大鼠模型,通过检测水通道蛋白、离子通道,分析影响肠黏膜通透性分子的信号通路,筛查相关基因和miRNAs,揭示IBS-D中肠黏膜水通道蛋白与肠黏膜屏障通透性的内在联系,并进一步阐明水通道蛋白在IBS-D发生时肠黏膜通透性改变和水液代谢中的作用及其调控机制,为临床治疗IBS-D提供新的思路和靶点。第一部分IBS-D大鼠结肠黏膜AQPs和离子通道异常表达的研究背景与目的:水通道蛋白家族是具有高选择性水的膜通道蛋白,分布广泛,与生物体内水的跨膜转运和水平衡的调节密切相关。离子通道被认为是细胞膜上的一类蛋白微孔道,具有特殊亲水性,是神经以及肌肉活动的物质基础。随着分子生物学研究的不断进步,水通道蛋白和离子通道的分子结构及特性也被更进一步地深入研究。研究显示离子通道和水通道蛋白的功能、结构改变能够导致众多胃肠疾病的发生、发展。新近研究表明IBS-D的发生机制与肠黏膜的通透性有关。IBS-D发生时肠黏膜上皮细胞水通道蛋白和神经、平滑肌上离子通道的构型、表达或通道电流是否存在改变,这些变化是否参与IBS-D的发生尚不明确。研究表明D-乳酸是反映肠黏膜通透性的重要血清学指标。本项目第一部分研究旨在建立IBS-D大鼠模型,通过检测血浆D-乳酸的表达差异,AQP1、AQP3、AQP8和离子转运体SGLT1、NHE1、CFTR在大鼠结肠黏膜的表达差异,揭示IBS-D与肠黏膜通透性的相关性,阐明肠黏膜通透性改变的分子机制,为进一步研究IBS-D水液代谢异常的机制网奠定基础。方法:参照文献及前期研究以应激以及直肠刺激的方法建立IBS-D大鼠模型。检测大鼠粪便含水量以及小肠推进率;ELISA法检测血浆D-乳酸、结肠组织AQP1、AQP3、AQP8的含量;免疫组化以及RT-PCR法检测AQP1、AQP3、AQP8和离子转运体SGLT1、NHE1、CFTR在肠黏膜组织的表达差异。结果:成功建立IBS-D大鼠模型,与对照组(1.060±0.105)ml相比,IBS-D组大鼠(1.807±0.294)ml的大便含水量明显增加(p<0.05)。IBS-D组大鼠的小肠推进率(67.65±5.142)%较对照组(46.60±8.288)%显著增加(p<0.05)。与对照组大鼠血浆D-乳酸含量(22.44±3.13)ng/ml相比,IBS-D组D-乳酸含量(49.79±3.55)ng/ml明显增加(p<0.05)。免疫组化法和ELISA法提示IBS-D大鼠肠黏膜AQP1、AQP3、AQP8的表达较对照组减少(p<0.05)。IBS-D大鼠肠黏膜SGLT1和NHE 1较对照组减少,CFTR较对照组增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:IBS-D大鼠大便含水量和肠动力增加,肠黏膜通透性增高,结肠黏膜AQP1、AQP3、AQP8、SGLT1和NHE1的表达下降,而CFTR表达增加,提示IBS-D发生水液代谢异常和肠黏膜通透性增加与结肠黏膜水通道蛋白及离子通道表达异常有关。第二部分IBS-D大鼠cAMP/PKA和NF-κB信号通路对肠黏膜AQPs表达的作用与机制研究背景与目的:核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一种多功能转录因子家族,它广泛存在于机体组织和细胞中,参与机体炎症反应、免疫反应、氧化反应、细胞凋亡等细胞的生理、病理过程。cAMP/PKA通路是一条经典的G蛋白偶联的细胞信号传导途径,参与多项细胞生理活动。本项目第二部分研究通过建立IBS-D大鼠模型,以NF-κB抑制剂PDTC、PKA抑制剂H89和cAMP激活剂forskolin作为干预,检测水通道蛋白 AQP1、AQP3、AQP8、NF-κB p65、p-CREB、IL-1β、TGF-β和TNF-α的变化,研究IBS-D发病过程中NF-κB信号通路和cAMP/PKA信号通路对AQP1、AQP3和AQP8表达的影响,阐明IBS-D的相关机制,同时探讨NF-κB和cAMP/PKA两条信号通路之间的cross-talk。方法:以应激及直肠刺激的方法建立IBS-D大鼠模型,以NF-κB抑制剂PDTC、PKA抑制剂H89和cAMP激活剂forskolin作为干预,通过RT-PCR,Western blot,免疫组化检测AQP1、AQP3、AQP8、p-CREB和NF-κB p65表达,并通过RT-PCR检测IL-1β、TGF-β和TNF-α的表达。结果:IBS-D模型组结肠黏膜AQP1、AQP3、AQP8和p-CREB的表达较对照组降低(p<0.05),NF-κB p65、IL-1β、TGF-β 和 TNF-α 的表达较对照组增加(p<0.05)。通过cAMP激活剂forskolin干预后,AQP1、AQP3、AQP8和p-CREB的表达较模型组增加(p<0.05),NF-κB p65、IL-1β、TGF-β和TNF-α的表达较模型组减少(p<0.05)。通过 NF-κB 抑制剂 PDTC 干预后,AQP1、AQP3、AQP8 和 p-CREB的表达较模型组增加(p<0.05),NF-κB p65、IL-1β、TGF-β和TNF-α的表达较模型组减少(p<0.05)。结论:cAMP/PKA信号通路与NF-κB信号通路均参与了 IBS-D的发生。IBS-D发生时,cAMP/PKA信号通路被抑制,NF-κB信号通路活化,AQP1、AQP3和AQP8表达下降,IL-1β、TGF-β和TNF-α表达增加。激活cAMP/PKA、抑制NF-κB信号通路可上调IBS-D肠黏膜AQP1、AQP3和AQP8并下调IL-1β、TGF-β和TNF-α的表达。第三部分IBS-D大鼠结肠组织基因和miRNA表达谱的变化背景与目的:miRNAs已被证实参与和调控多种生理过程,包括细胞凋亡和分化、脂质的代谢、神经元的发育以及激素分泌等。但目前关于miRNAs的研究多集中于肿瘤,对于功能性胃肠病,尤其是IBS相关性miRNA的研究并不多见。本项目第三部分研究通过应激以及直肠刺激建立IBS-D大鼠模型,采用液相芯片技术以及PCR筛选并验证IBS-D大鼠结肠组织基因和miRNA表达谱,并进一步对比IBS-D大鼠与正常对照组大鼠基因和miRNAs的表达差异,为进一步揭示IBS-D发病机制奠定基础。方法:以应激以及直肠刺激的方法建立IBS-D大鼠模型,通过液相芯片技术筛选IBS-D大鼠结肠黏膜表达差异的基因与miRNAs,并通过RT-PCR进行验证,进一步对比IBS-D大鼠与正常大鼠基因和miRNAs的表达差异。结果:对照组、模型组直肠注水量分别为(1.52±0.09)ml和(0.77±0.08)ml,具有统计学差异(p<0.05),提示造模成功。筛选出的基因(htr4、htr1a、2r13、nos1、Calca、npy、crhr2、il1b、p2rx3、nos2、tph1、crhr1、hmox1、trpv1、Vip、f2r1、tgfb1、htr3a、s1c6a4、tff2)中,通过 PCR 验证发现 nos1、il1b、htr3a 在模型组结肠组织中表达上调。在筛选出的miRNAs(let-7f、let-7i、miR-130b、miR-29a、miR-132、miR-21、miR-375、miR-24、miR-31a、miR-192、miR-221、miR-223、miR-23 a、miR-23 b、miR-122-5p、miR-143、miR-145、miR-146a、miR-199a、miR-200b、miR-217)中,发现 miR-29a、let-7f、let-7i、miR-130b、miR-132、miR-21、miR-375在IBS-D大鼠结肠黏膜中表达明显较对照组增加(p<0.05)。而miR-24、miR-31a、miR-192、miR-221、miR-223在IBS-D大鼠结肠黏膜中表达明显减少(p<0.05)。miR-23a、miR-23b、miR-122-5p、miR-143、miR-145、miR-146a、miR-199a、miR-200b、miR-217在结肠黏膜中的表达模型组和对照组无明显差异(p>0.05)。结论:IBS-D大鼠结肠基因nosl、il1b、htr3a表达异常,且存在着多个表达上调的 miRNAs,如 miR-29a、let-7f 等,和表达下调的 miRNAs,如 miR-24、miR-31a等。第四部分IBS-D大鼠基于miR-29a调控结肠黏膜AQPs在肠黏膜屏障功能障碍中的作用背景与目的:水通道蛋白在肠屏障水液代谢中具有重要作用,研究表明AQP1、AQP3和AQP8与结肠的水液代谢关系密切。在第三部分研究中,我们发现IBS-D的发生与多个miRNAs的变化有关,其中miR-29a在IBS-D大鼠模型结肠黏膜的表达显著上调。而新近有研究提示miR-29a参与IBS的发病,其机制可能与肠黏膜的通透性有关,而具体机制尚不明确。本项目第四部分研究通过培养IBS-D大鼠结肠上皮细胞,采用RT-PCR法检测评估IBS-D大鼠肠上皮细胞中钾离子浓度和LDH的表达,通过进一步抑制miR-29a的表达,采用Western blot检测AQP1、AQP3和AQP8的表达变化,从而揭示miR-29a影响肠黏膜通透性的分子机制和对于IBS-D发病相关的水通道蛋白的影响。方法:通过应激以及直肠刺激建立IBS-D大鼠模型,培养原代结肠上皮细胞并加以验证,以miR-29a抑制剂作为干预手段,分为正常细胞对照组,IBS-D细胞组,miR-29a抑制对照组以及miR-29a抑制组四组,采用RT-PCR法检测评估IBS-D大鼠结肠上皮细胞中miR-29a、钾离子浓度和LDH的表达,通过Western blot检测AQP1、AQP3 和 AQP8 的表达。结果:与正常组相比,IBS-D组中miR-29a的表达显著升高(p<0.001),钾离子浓度降低(p<0.05),LDH浓度显著升高(p<0.001),AQP1、AQP3和AQP8的表达降低(p<0.05)。与miR-29a抑制对照组相比,miR-29a抑制组中miR-29a的表达显著降低(p<0.001),钾离子浓度显著升高(P<0.05),LDH浓度显著降低(p<0.01),AQP1、AQP3 和 AQP8 的表达显著增高(p<0.001)。结论:IBS-D大鼠原代结肠上皮细胞miR-29a表达升高,AQP1、AQP3和AQP8表达降低,肠上皮通透性增高。抑制肠上皮细胞miR-29a表达可使AQPs表达显著增高,进而改善肠上皮通透性。总结论:IBS-D大鼠大便含水量和肠动力增加,肠黏膜通透性增高,结肠黏膜AQP1、AQP3、AQP8、SGLT1和NHE1的表达下降,而CFTR表达增加,提示IBS-D发生水液代谢异常和肠黏膜通透性增加与结肠黏膜水通道蛋白及离子通道表达异常有关。cAMP/PKA信号通路与NF-κB信号通路均参与了 IBS-D的发生。IBS-D发生时,cAMP/PKA信号通路被抑制,NF-κB信号通路活化,AQP1、AQP3和AQP8表达下降,IL-1β、TGF-β和TNF-α表达增加。激活cAMP/PKA、抑制NF-κB信号通路可上调IBS-D肠黏膜AQP1、AQP3和AQP8并下调IL-1β、TGF-β和TNF-α的表达。IBS-D大鼠结肠基因nosl、il1b、htr3a表达异常,且存在着多个表达上调的 miRNAs,如 miR-29a、let-7f 等,和表达下调的 miRNAs,如 miR-24、miR-31a等。IBS-D大鼠原代结肠上皮细胞miR-29a表达升高,AQP1、AQP3和AQP8表达降低,肠上皮通透性增高。抑制肠上皮细胞miR-29a表达可使AQPs表达显著增高,进而改善肠上皮通透性。