【摘 要】
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丹酚酸酯酶能够特异性地水解丹酚酸B,生成丹参素和Przewalskinic acid A。本文主要对微生物Absidia sp.D30s产丹酚酸酯酶的分离纯化和基因调取进行了研究。确定了Absidia sp.
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丹酚酸酯酶能够特异性地水解丹酚酸B,生成丹参素和Przewalskinic acid A。本文主要对微生物Absidia sp.D30s产丹酚酸酯酶的分离纯化和基因调取进行了研究。确定了Absidia sp.D30s菌产丹酚酸酯酶的最佳发酵条件,诱导物的最佳比例为:丹参浸出液:麸皮浸出液=1:1;菌种的最佳培养时间为144h。实验采用葡聚糖凝胶层析、DEAE-纤维素阴离子交换层析将由微生物Absidiasp.D30s中诱导生成的丹酚酸酯酶进行了分离纯化,经SDS-PAGE测定该单亚基酶分子量约为37kDa。丹酚酸酯酶的最适反应温度为40 ℃,酶活在20-50 ℃稳定;最适反应pH是5.0,pH稳定范围是3.0-6.0。K+、Na+、Ca2+、Mg2+4种金属离子对酶活力的影响很小;高浓度的Zn2+对酶活力有抑制作用;而金属离子Cu2+、Fe3+对酶反应有明显的抑制作用。将纯化的丹酚酸酯酶经过电印迹转移后,测定蛋白质N端序列为ALTXQVSAPI(X为未知)。根据丹酚酸酯酶的N端序列设计出简并引物进行基因序列的调取。首先提取出产丹酚酸酯酶的菌种Absidiasp.D30s的总RNA,根据丹酚酸酯酶的N端序列设计引物,以总RNA为模板进行RT-PCR,扩增出CDS区基因片段并测序。将测序结果进行生物学信息分析并构建信息树,得到丹酚酸酯酶与Aspergillus oryzae菌产生的肽酶亲缘性较高。
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