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背景热休克反应(heat shock response,HSR)是生物机体在应激状态下所表现的,以热休克蛋白诱导表达为特征的自我保护反应。热休克蛋白应用其分子伴侣活性对修饰应激而致的变性蛋白结构的正确折叠或引领变性蛋白在溶酶体,Ubquitin-proteasome降解,从而稳定细胞的内稳态。热休克反应主要受热休克转录因子(heat shock factor,HSF)调控。热休克转录因子结合基因启动子的热休克元件调节表达热休克蛋白基因的转录表达。哺乳类动物表达4个HSF家族成员。Hsf4是这个家族成员之一,是晶状体中执行热休克反应的主要转录因子。有研究发现,Hsf4功能异常导致晶状体分化异常和白内障的发生。白内障分为先天性白内障和老年性白内障。先天性白内障是胚胎时期晶状体发育异常所致,其发育过程伴随很多的凋亡发生;老年性白内障为白内障主要类型,占白内障病人的80%,75岁以上的老年人患病率为70%,其病因是晶状体受到外界的高温,缺氧,紫外照射等不良环境的影响,促使晶状体蛋白变性甚至导致细胞凋亡引起的。Hsf4是调控晶状体发育的关键因子,Hsf4a和Hsf4b是其两种亚型,其中Hsf4b是调节晶状体发育的唯一亚型。我们前期研究结果发现,在晶状体上皮细胞内,Hsf4参与调控αB-crystallin和Hsp25等小分子伴侣的表达。Roxana Chis发现,小鼠心肌细胞受到H2O2刺激后,αB-crystallin能从细胞胞质中转移到线粒体膜上,并且与VDAC,TOM20,caspase 3和caspase 12相互作用,从而抵抗H2O2刺激导致的细胞凋亡。其它研究也证明了αB-crystallin在心肌细胞与小鼠子宫内膜间质细胞中,与线粒体凋亡通路直接作用,抵抗内质网折叠压力,过氧化和炎症等各种细胞压力导致的细胞凋亡。因此,我们推论Hsf4b通过上调αB-crystallin蛋白表达,抑制外界诱导的晶状体细胞凋亡。本课题利用敲除和过表达Hsf4b的晶状体上皮细胞,进一步探讨Hsf4b在晶状体上皮细胞中的抗凋亡的分子机制。目的研究晶状体上皮细胞中,Hsf4及其下游蛋白αB-crystallin抵抗细胞凋亡具体的分子机制。方法1.用caspase-3检测试剂盒检测caspase-3的活性,用免疫印迹检测cleaved caspase-3和hsf4b下游相关基因的蛋白水平和ERK和p-ERK的蛋白水平,。2.利用线粒体膜电位检测试剂盒检测线粒体膜电位。3.利用线粒体分离实验,免疫印迹检测线粒体蛋白和胞质蛋白中细胞色素C和Hsf4b下游蛋白αB-crystallin的蛋白量。4.用免疫荧光实验观察细胞色素C、Bax、αB-crystallin和线粒体的共定位。5.用流式细胞术检测细胞凋亡。6.pull-down实验验证了αB-crystallin与细胞色素C和促凋亡因子Bax存在相互作用。7.用活性氧检测试剂盒检测细胞内的活性氧水平。结果在晶状体上皮细胞中,Hsf4b具有稳定线粒体膜势((35)Y),抑制顺铂,双氧水刺激诱导的细胞凋亡作用,其机理之一:Hsf4b通过αB-crystallin抑制Bax蛋白从细胞胞质向线粒体膜转移,抑制Bax和细胞色素C相互作用,阻止细胞色素C从线粒体向细胞胞质中的释放和降低细胞内ROS的产生。结论Hsf4和它的下游蛋白αB-crystallin通过抑制细胞凋亡保护晶状体上皮细胞的自我平衡。