苹果11号染色体果糖QTL定位与候选基因功能验证

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苹果的果实风味主要由果实中可溶性糖和有机酸的含量及比例决定,其中果糖是最甜的可溶性糖,它的甜度是蔗糖的1.73倍,是葡萄糖的2.34倍。因此,探明苹果果实中果糖含量积累与遗传调控机制,挖掘关键基因,对于苹果甜味品质育种具有重要意义。本研究以‘蜜脆’(‘Honeycrisp’,高果糖)ב秦冠’(‘Qinguan’,低果糖)杂交F1代果实为材料,结合高密度遗传连锁图谱,在LG(Link group)11上鉴定出控制苹果果糖含量的数量性状位点(QTL),结合SNP注释与转录组数据筛选出调控果实果糖含量的候选基因MdTrx m4,通过遗传转化与原核表达分析对该基因功能进行了研究,获得的主要结果如下:1.‘蜜脆’果实中果糖含量显著大于‘秦冠’。以‘蜜脆’ב秦冠’杂交F1代为材料,连续两年对其果实中果糖含量进行测定分析,结果表明杂交后代中果糖含量分布广泛且成正态分布,符合数量性状遗传特点,两年果糖含量平均值分别为46.54±6.75、56.25±8.82 mg/g FW。通过对苹果果糖含量的QTL定位分析,2015年与2016年在‘秦冠’LG11上定位到了2个QTL位点,在‘蜜脆’LG11上定位到了3个QTL位点,其中‘蜜脆’LG11上存在一个连续两年稳定的QTL重叠区间。2.‘蜜脆’LG11上的重叠区间内共有12个基因,结合亲本重测序与SNP注释发现这12个基因中有6个基因的外显子上发生了可遗传的氨基酸变异。结合‘秦冠’和‘蜜脆’果实发育时期的转录组数据,进一步分析发现候选基因MD11G1224900在‘秦冠’幼果期与成熟期的表达量均低于‘蜜脆’中的表达量,qRT-PCR结果表明该基因在‘秦冠’与‘蜜脆’果肉中的表达量与果糖含量正相关。3.以‘秦冠’和‘蜜脆’的cDNA为模板克隆出MdTrx m4,序列比对分析发现该基因在‘秦冠’和‘蜜脆’中各存在两种单倍型,分别命名为Q1-MdTrx m4、Q2-MdTrx m4、M1-MdTrx m4、M2-MdTrx m4。生物信息学分析发现Q1-MdTrx m4与其它三种蛋白质在理化性质、亲疏水性、二级结构上均存在较大差异。4.对四种单倍型分别构建了过表达载体和MdTrx m4干扰载体,瞬时转化‘王林’苹果果肉愈伤后测定果糖含量。发现在过表达MdTrx m4苹果果肉愈伤中,单倍型Q1-MdTrx m4的果糖含量与对照相比无明显变化,其它三种单倍型转基因愈伤中果糖含量上升20%-30%。而干扰转基因愈伤中,果糖含量下降了15%-20%。5.成功构建四种单倍型的原核表达载体并诱导出蛋白质。蛋白可溶性分析发现相同诱导条件下蛋白质Q1-MdTrx m4包涵体多于可溶性蛋白,其他三种蛋白质则相反。
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