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第一章自体血清培养人骨髓间充质干细胞的可行性评估目的：胎牛血清体外培养的人骨髓间充质干细胞增加体内移植的风险,限制其临床应用。本部分实验旨在探讨自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的可行性。方法：全骨髓贴壁培养法分离、纯化人骨髓间充质干原代细胞,取第三代细胞按加入培养血清的不同分为胎牛血清培养组和自体血清培养组。倒置相差显微镜观察两组培养细胞的生长情况；使用MTT法测定两组培养传代第3代细胞和第5代细胞的增殖情况,绘制细胞增殖曲线；取两组培养传代第3代细胞行成软骨细胞、成骨细胞及成脂肪细胞诱导分化,并分别对成软骨细胞行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原染色；对成骨细胞行碱性磷酸酶(ALP)染色、VonKossa染色；对成脂肪细胞行油红O染色,并计算两组细胞诱导分化阳性率；取自体血清培养组传代第5代细胞行流式细胞仪测定鉴定细胞表面CD44. CD90抗原表达情况。结果：倒置相差显微镜下观察全骨髓贴壁法分离纯化的原代细胞形态均一,呈长梭形,两组培养细胞近融合状态均呈漩涡样同向生长特征；MTT测定两组培养第3代及第5代细胞均具备良好的生长增殖潜能,第3-6d是增殖对数增长期,两组细胞增殖无统计学差异；两组培养第3代细胞均能在特定诱导环境下向成软骨细胞、成骨细胞及成脂肪细胞分化,成软骨细胞经甲苯胺蓝染成蓝紫色,Ⅱ型胶原染成黄色；成骨细胞碱性磷酸酶染色(ALP)阳性,VonKossa钙结节染成黑色；成脂肪细胞内经油红O染成红色脂滴,两组诱导分化细胞阳性率无统计学差异；自体血清培养组第5代细胞经流式细胞仪鉴定细胞表面不表达CD34、CD45,而表达CD44、CD90。结论：全骨髓贴壁培养法操作简单,细胞纯化率高；自体血清培养组细胞保持了骨髓间充质干细胞典型的生长特征、增殖以及诱导分化潜能；自体血清培养组细胞表面不表达造血干细胞表面抗原,而表达骨髓间充质干细胞表面抗原,符合骨髓间充质干细胞特征。第二章CPC/FG/OM复合材料的研制及理学性质测定目的：股骨头坏死是临床治疗上颇为棘手的问题之一。有研究表明坏死股骨头软骨下骨板的支撑是治疗股骨头坏死的关键因素。磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)材料是一种兼备修复与成型的骨组织修复材料,具备自固化与骨传导特性。但是由于材料本身的缺陷存在抗压强度低,无骨诱导活性等缺点,限制了其在人体负重区域的临床应用。纤维蛋白胶(fibrin glue, FG)是临床上广泛应用的粘合剂,与CPC复合能够利用其粘性增加CPC的抗压强度。成骨诱导剂(osteogenesis medium, OM)已被证实对骨髓间充质干细胞有着诱导成骨分化的作用。本部分实验旨在研制一种新型的适用于治疗股骨头坏死的填充材料—CPC/FG/OM复合材料,以期复合材料即能够保留单纯CPC材料自固化及优良骨传导性的优点,又能够通过加入FG增强材料的抗压强度以满足人体负重区域抗压强度要求以及加入OM增加材料的成骨诱导活性以改善坏死股骨头内的成骨内环境。方法：将OM加入FG中制备FG/OM溶液,按照3：1的粉末/液体比例配置CPC/FG/OM复合材料,按照相同的粉末/液体比值配置CPC/FG复合材料及CPC材料作为两组对照组。对三组材料进行扫描电镜观察材料表面结构；XRD晶体分析；凝固时间(吉尔摩针法)、抗压强度、弹性模量(MTS S10力学性能实验机测试)以及孔隙率的测定(阿基米德法)。结果：三组材料扫描电镜观察发现单纯CPC材料表面孔隙分布均匀,孔隙较小,而CPC/FG及CPC/FG/OM两种复合材料表面孔隙分布不均匀,孔隙尺寸大；XRD分析显示三种材料的XRD曲线与羟基磷灰石相似；CPC/FG及CPC/FG/OM两种材料初凝时间[(6.8±0.5)min,(7.28±0.6)min]明显长于CPC材料[(3.38±0.4)min],差异有统计学意义(P<0.05),三种材料终凝时间差异无统计学差异(P>0.05); CPC/FG及CPC/FG/OM两种材料抗压强度及弹性模量[(8.94±0.5)MPa,(9.1±0.4) MPa;(2.73±0.07)GPa,(2.846±0.1)GPa]明显高于CPC材料组[(5.08±0.5)MPa,(1.064±0.14)GPa],差异有统计学意义(P<0.05)；CPC/FG及CPC/FG/OM两种材料孔隙率[(38.64±1.5)%,(37.9±1.4)%]明显低于CPC材料组[(48.82±8.2)%],差异有统计学意义(P<0.05)。结论：三种材料晶体相与羟基磷灰石一致,证实体内降解产物与人体骨骼无机成分相同；CPC/FG/OM复合材料中OM的加入没有影响其理学性质：凝固时间满足临床经皮穿刺的可注射性要求；抗压强度及弹性模量与CPC/FG复合材料相仿,明显高于CPC材料,达到坏死股骨头软骨下骨板的填充材料抗压强度要求；孔隙率与CPC/FG复合材料相仿,明显低于CPC材料,但是由于其表面呈大尺寸孔隙特征,有利于种子细胞早期帖附。第三章CPC/FG/OM复合材料与hBMSCs体外共培养的实验研究目的：股骨头坏死的治疗涉及到重建生物力学坚强(坏死股骨头软骨下骨板的支撑)和重建生物学坚强(坏死股骨头内源性的修复)。目前骨组织工程以及干细胞工程的兴起使得骨髓间充质干细胞移植成为未来治疗股骨头坏死的新方向。实验二已经证实CPC/FG/OM复合材料满足即时重建坏死股骨头生物力学坚强要求,本部分实验将CPC/FG/OM复合材料与自体血清培养的hBMSCs共培养,探讨CPC/FG/OM复合材料的生物相容性和成骨诱导性能。方法：三组材料按实验二步骤制备。hBMSCs按实验一步骤准备。将三种材料各放置入24孔板,hBMSCs接种。扫描电镜观察细胞在三组材料上的生长粘附情况；MTT法检测培养第1至7d细胞在三组材料上的生长增殖情况；RT-PCR检测细胞在三组材料中培养7d后的碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原蛋白(COL-I)、骨钙素(OCN)mRNA的表达水平；并分别检测细胞在三组材料中培养第3d,第7d,第14d碱性磷酸酶活性(pNPP法)以及骨钙素含量(ELISA法)。结果：扫描电镜观察细胞在三组材料上均可以粘附生长,CPC组细胞间连接较少,CPC/FG和CPC/FG/OM两组细胞间连接多,细胞外基质分泌较多；MTT法检测细胞在CPC/FG和CPC/FG/OM两组增殖较CPC组增殖快；碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原蛋白(COL-I)、骨钙素(OCN)在CPC/FG/OM组表达最强,CPC/FG组次之,CPC组最弱。结论：CPC/FG, CPC/FG/OM以及CPC/FG/OM复合材料生物相容性均良好,但是CPC/FG/OM复合材料诱导成骨能力明显高于CPC/FG组与CPC组。第四章经皮穿刺CPC/FG/OM复合材料股骨头填充联合hBMSCs移植治疗股骨头坏死的动物实验研究目的：通过动物实验观察经皮穿刺CPC/FG/OM复合材料股骨头填充联合hBMSCs移植治疗股骨头坏死的效果方法：采用激素加内毒素法建造新西兰大白兔股骨头坏死动物模型(耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素(10ug/kg),并同时在兔臀部肌肉注射甲基泼尼松龙(40mg/kg),共注射3次,每次间隔24h),取股骨头坏死造模成功的24只大白兔随机分为四组,A组：经皮穿刺组(单纯减压组)；B组：经皮穿刺+hBMSCs移植组；C组：经皮穿刺CPC/FG/OM复合材料股骨头填充组；D组：经皮穿刺CPC/FG/OM复合材料股骨头填充+hBMSCs移植组。其中每组6只,一侧行手术操作,对侧不进行任何操作作为对照组。在术后第4、8、12w进行影像学评估(x-ray检查评估股骨头坏死转归情况)和组织学评估(HE染色、软骨下骨区域成骨细胞计数和陷窝面积百分比计算)。结果：A组,B组与对照组比较治疗效果不明显,影像学评估与对照侧无明显差别,早期出现股骨头坏死进展迹象(软骨下骨囊性变区域增多,关节间隙变窄),组织学大体观察示股骨头多处凹陷区域,股骨头色泽变白,HE染色显示坏死股骨头软骨下骨区域少见成骨细胞及骨基质形成,12w软骨下骨区域成骨细胞计数和陷窝面积百分比计算与对照侧比较差异无统计学意义；C组和D组与A组、B组及对照组比较治疗效果明显,12w影像学评估两组治疗侧股骨头圆形外观保持良好,未见股骨头囊性变区域,C组材料影清晰,与骨界限清楚,D组材料影模糊,与骨界限不清楚,周围有新骨生成影像。组织学大体观察示C组治疗侧股骨头色泽发白,D组色泽正常,HE染色示C组较D组髓内新骨基质形成较少,成骨细胞少。治疗12w软骨下骨区域成骨细胞计数和陷窝面积百分比计算与D组比较差异有统计学意义。结论：动物实验结果显示经皮穿刺CPC/FG/OM复合材料填充联合hBMSCs移植治疗股骨头坏死治疗效果明显,优于髓芯减压组,hBMSCs移植组,单纯CPC/FG/OM复合材料填充组。