N~6-methyladenosine(m~6A)修饰是RNA中腺嘌呤的第六位氮原子上发生的甲基化,其生物学功能受多种甲基化酶、去甲基化酶和识别蛋白调控。m~6A修饰在脊椎动物胚胎发育中起重要的作用,因该修饰仅占mRNA中总腺苷的0.1-0.4%,小鼠胚胎难以提供充足的实验材料进行相关分子机制研究。鉴于此,热带爪蛙为研究m~6A修饰调控胚胎发育的分子机制提供了良好模型。本研究首先通过斑点印迹分析发现,m~6A广泛存在于热带爪蛙早期胚胎中。利用整体原位杂交分析m~6A修饰相关甲基化酶、去甲基化酶及识别蛋白在热带爪蛙早期胚胎中的表达发现,甲基化酶基因mettl3、mettl14和wtap主要表达在热带爪蛙早期胚胎动物极细胞和神经嵴。去甲基化酶基因fto在早期胚胎中表达量很低,alkbh5表达在动物极细胞和神经嵴。识别蛋白基因ythdf1、ythdf2、Ythdf3、ythdc1、ythdc2和hnrnpc的转录本主要表达在动物极细胞、神经嵴和眼睛等,Western blot证实这些基因的蛋白在所分析的各发育时期均有表达。另外,RT-PCR分析表明,识别蛋白基因ythdf1、ythdf2、ythdf3、ythdc1和ythdc2在热带爪蛙的多种成体组织器官中均有表达。这些结果提示RNA m~6A修饰广泛参与热带爪蛙胚胎发育的调控。利用CRISPR/Cas9技术在热带爪蛙中对m~6A识别蛋白基因ythdf1、ythdf2、ythdf3、ythdc1和ythdc2进行了敲除,已获得ythdf1、ythdf2和ythdf3敲除的健康F1杂合子,纯合子尚有待进一步传代获得。用G0代雌性亲本通过孤雌生殖获得的ythdf3敲除的纯合子胚胎发育正常,因此,Ythdf3在热带爪蛙胚胎发育中的作用尚难以鉴定。总之,本研究为系统认识RNA m~6A修饰调控热带爪蛙胚胎发育奠定了良好基础,已经建立的基因敲除亲本便于后续敲除品系的建立、突变体纯合子获取及功能分析。