糖基化是蛋白质发生的最为普遍的翻译后修饰之一。人体50%以上的蛋白质被认为含有糖基化修饰。糖基化在免疫反应、生殖过程、神经发育、细胞凋亡和衰老、肿瘤发展和转移、病原体感染等生物过程中起到重要作用。在肿瘤的发生中，也观察到众多糖蛋白的糖型发生改变。已有报道表明在肿瘤中糖型的主要变化包括岩藻糖化增强、唾液酸化增强、增加额外的聚乳糖胺、糖链分支增加等。虽然这些特异糖型的改变在肿瘤发生和发展过程中的作用还不是很清楚，但是利用这些糖型的特异改变作为潜在的生物标志物却变得可能。甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）作为传统的筛查原发性肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）的指标，其诊断价值一直受到人们评价和质疑。事实上，AFP在生殖细胞肿瘤(nonseminomatous germ cell tumor，NSGCT)、肝内胆管癌(non-seminomatous，ICC)和胃癌有时也会升高，在慢性乙肝患者中AFP升高比例为15%～58%，在肝硬化患者中该比例为11%～47%，这些情况就会导致AFP检测特异性的降低，尤其在慢性肝病的高危人群中，AFP对HCC患者检测的有效性就大打折扣。进一步研究表明，AFP的糖型异质体，能够作为独立于AFP的肝癌标志物。其中AFP-L3是扁豆凝集素（LCA）结合的主要成分，是HCC患者血清中AFP的主要形式，已被FDA批准为辅助检测HCC的标志物。已有研究报道，其检测灵敏度与AFP相近，但其检测特异性为92.5%高于AFP的检测特异性75.3%。已有的检测AFP糖型异质体的方法都是基于凝集素与特异糖型的结合。这些检测方法有其局限性。首先，凝集素是针对某类糖型而特异性结合，不能对每一种糖型进行定量检测；其次，基于凝集素的检测是在糖蛋白水平进行的，反映的是全部糖型的变化，不能提供特定位点的糖型变化。针对这些问题，我们提出了免疫亲和富集和质谱多反应监测（MRM）技术联用的策略，对血清中AFP的各种糖型进行定量检测。在本论文的第一部分，利用高分辨率和高准确度的新型质谱，我们建立了识别与定性分析完整糖肽和简易糖肽的技术策略。与传统的基于MALDI糖链鉴定策略相比，具有以下优点：首先解决了传统糖基化研究中肽段与糖链分开解析而导致位点特异性信息丢失的问题；其次，所需的样品量远低于传统用量，只需500fmol的标准蛋白上样，就能够得到大量的糖肽图谱信息用于确定糖链结构；再次，我们的技术有利于唾液酸化糖肽的检出。最后，我们鉴定到16种AFP糖肽，可用于下一步完整糖肽MRM方法的建立。在论文的第二部分，我们建立了AFP完整糖肽的MRM检测方法。系统研究了完整糖肽和简化糖肽在三重四极杆质谱中的碎裂行为，建立了完整糖肽碰撞能量优化的方法，比较了多个糖特征离子用于定量分析的差异，首次提出糖特征离子138和366是最优的检测糖肽的子离子，而且二者的定量结果具有高度一致性。接着完成了对该方法的检测限、线性范围、重现性等方面的系统考察。最后，成功利用优化好的MRM技术对来源于脐带血的AFP的糖肽和简化糖肽进行了定量分析。本方法的建立，将我们实验室前期建立的基于MRM技术检测简化核心岩藻糖化糖肽的定量方法，推进到完整糖肽的水平。同时我们提出的利用糖肽（或简化糖肽）与非糖肽的比值作为检测指标的策略，既考虑了糖基化修饰的变化，又考虑了蛋白质总量的变化，有利于更准确的反映糖蛋白生物标志物的变化。在论文的第三部分，我们建立了兼容下游质谱定量检测的免疫亲和富集方法。在实际血清样本中，实现了10ng/mL的检测限。利用优化后的亲和免疫-MRM技术，我们在15例肝硬化患者和22例肝癌患者中检测了16种糖肽和Endo F3（endoglycosidase F3）处理后的简化糖肽的变化，结果表明，3种糖肽G3、G6、G13以及简化糖肽在肝癌组和肝硬化组中差异显著，有望成为新的肝癌标志物，它们与内源非糖肽的比值，有望成为新的肝癌检测指标，用于区分肝癌和肝硬化患者。在论文的第四部分，针对酶切过程中的过烷基化对于后续的定性和定量分析可能造成不可控的影响，我们模拟常用的酶切条件，首次系统的研究了蛋白质真实酶切时所有酶切肽段发生烷基化的情况。得出了氨基酸过烷基化的规律，评价了过烷基化对于后续定量分析的影响。论文的最后部分，我们利用SILAC（stable isotope labeling by amino acids）技术研究了高致病性H5N1禽流感病毒感染A549细胞蛋白质组的变化。共鉴定到3504个蛋白质，有定量信息的蛋白为2469个，病毒感染后表达量升高的蛋白质为72个，表达量降低的蛋白质为66个，其中包括多个分子调控途径中的关键蛋白因子。为探索高致病性H5N1禽流感病毒致病的分子机理提供了理论基础。