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Bt(Bacillus thuringiensis)蛋白与昆虫中肠 BBMV(Brush Border Membrane Vesicles)上特异性受体蛋白的结合是其杀虫过程中的关键环节。只有对Bt受体蛋白进行系统的研究才能确定哪种受体在Bt作用过程中起关键作用,最终才能明确Bt受体这一环节在Bt整个作用过程中扮演的角色。本研究从棉铃虫的氨肽酶N这一受体出发,克隆得到了 HaAPN1-7基因全长序列,对几种不同Bt耐受品系棉铃虫中APN1-7表达量的差异、APN肽段与CrylAc、Cry2Aa、Vip3Aa的体外结合特性、APN肽段对CrylAc、Cry2Ab、Vip3Aa的毒力的影响、饲喂Cry1Ac、Cry2Ab、Vip3Aa后抗感棉铃虫中肠BBMV和中肠酶液中APN活性的变化等进行了研究,结果为明确APN在Bt抗性发展中的作用、为Bt抗性机理的研究奠定理论基础。主要研究结果如下:1.利用PCR技术克隆得到了HaAPN1-7基因全长(Genbank登录号:MT002819-MT002825),并进行了生物信息学分析。结果显示除HaAPN7以外,HaAPN1-6都具有氨肽酶N家族典型的 GAMENWG 和 HEX2HX18E 保守基序;HaAPN1-7 全长 CDS 为 2592-3099 bp,氨基酸为 863-1032 aa,分子量为 110-115 KDa,等电点为 4.7-6.4,N 端信号肽为 15-20 aa;HaAPNs 1,2,3的C末端都有一段多聚苏氨酸序列;HaAPN1-7蛋白C末端都有一个GPI锚定位点;HaAPNs1,2,3的O-糖基化位点有16-39个;除了HaAPN2无N-糖基化位点,其余HaAPNs均有1-8个N-糖基化位点。系统进化分析表明HaAPN1-7分属于Classl-7类别。2.通过荧光定量 PCR 技术比较了HaAPNs在96S、BtR3.6、BtR1.1、96S-Cry2Ab、96S-Vip3Aa品系棉铃虫中表达量的差异。结果显示:各品系中HaAN1-7表达量差异显著,HaAPN2表达量最高,HaAPN7表达量最低;HaAPN2和HaAPN5在棉铃虫BtR3.6抗性品系中表达量呈显著上调趋势,HaAPN2在Cry2Ab抗性品系中表达量呈显著上调趋势。总体来说APN在抗性品系棉铃虫中上调表达。3.截取了HaAPN2和HaAPN5的两个β折叠区域,原核表达得到HaAPN2a、HaAPN2b、HaAPN5a、HaAPN5b 四个 APN 肽段,Ligand blot 实验结果显示 HaAPN2a、HaAPN5a、HaAPN5b可以和活化的CrylAc结合;HaAPN2a、HaAPN5a可以和Cry2Aa结合,但结合较微弱;HaAPN2a、HaAPN2b、HaAPN5a、HaAPN5b 均不能和Vip3Aa 结合。ELISA 测定结果显示HaAPN2可以活化的CrylAc结合,且结合常数为(56.06± 15.28)nM。将HaAPN2(1-825 bp)和HaAPN5(1-798 bp)分别转染Sf9细胞,细胞生测结果显示这两个APN肽段不参与Cry1Ac和Cry2Ab的毒性过程。将原核表达的HaAPN2a肽段与Cry1 Ac、Cry2Ab、Vip3Aa混合饲喂棉铃虫进行生测,结果显示HaAPN2a肽段对三种Bt蛋白既无增效也无抑制作用。4.饲喂CrylAc、Cry2Ab、Vip3Aa蛋白后抗、感品系棉铃虫中肠APN活性的变化结果显示96S敏感品系棉铃虫在取食Bt蛋白后中肠BBMV上和中肠酶液中APN活性下降,BtR3.6、96S-Cry2Ab和96S-Vip3Aa品系棉铃虫在取食Bt蛋白后中肠酶液中APN活性上升但BBMV上APN活性变化不明显。抗感品系棉铃虫中肠APN活性变化存在显著差异。