结核病是全球性的公共传染病,由结核分枝杆菌感染引导致,严重危害公共安全。在牛养殖业中,结核分枝杆菌的防控有助于维护奶制品和肉制品的安全以及饲养人员和消费者的健康。因此,在畜牧生产中,对牛结核分枝杆菌开展快速、灵敏的特异性检测至关重要。当前,我国牛结核病诊断和检疫方法主要是病原分离鉴定和结核菌素皮内变态反应,然而结核分枝杆菌的分离需要专业实验室且具有一定的风险性,而皮内变态反应耗时较长,易受到环境结核分枝杆菌的干扰和主观判断错误,亟需建立快速安全的检测方法。本研究通过建立一种多重PCR检测方法,能够作为牛结核分枝杆菌诊断的有力补充。目的与方法:通过大量的序列比对和分析,获得可区分致病性与非致病性结核分枝杆菌病原核酸PCR的靶基因,并根据这些候选基因设计多重PCR引物,通过组合优化,最终建立可以区分致病性和非致病性分枝杆菌病原核酸的多重PCR鉴别诊断方法,并通过大量的临床样品,与皮内变态反应及牛IFN-γ释放试验进行比对,验证建立方法的敏感性和特异性。结果:在深入分析各分枝杆菌属细菌基因组序列后,确定了 7条特异性引物,通过针对16S rRNA基因的特异性基因,能够区分感染的是分枝杆菌属或非分枝杆菌;使用RV3873基因上的特异性引物,可区分卡介苗BCG和结核分枝杆菌群其他成员感染;使用RV1506c基因上的特异性引物,将结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌感染进行区分。通过使用这7条引物组合进行多重PCR反应,从而能简单、快速且准确地鉴别各种分枝杆菌。通过对1504份的临床样品检测,并且与巢式PCR、结核菌素皮内变态反应和牛IFN-γ释放试验进行结果比较,检测率分别为8.71%、26.13%、8.31%和6.45%。多重PCR检测方法检测率更加接近于牛IFN-γ释放试验的检测率,显著低于牛结核菌素皮内变态反应的阳性检测率。结论:建立的牛结核分枝杆菌多重PCR检测方法可以排除大量的假阳性病例,可作为牛结核分枝杆菌诊断的有力补充。