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乳房炎是影响奶牛生产经济效益和动物福利最常见的炎症疾病,为了降低奶牛乳房炎的发病率,育种工作者已经将重点转移到乳房炎抗性奶牛的培育。其中,候选基因法被认为是有效的方法,其目的在于发现单核苷酸多态性(SNP),即使该致病基因是微效基因,候选基因法也会对该微效基因进行挖掘。在本研究中,共研究5个炎症基因,包括CD4基因、LAG3基因和其他3个涉及JAK-STAT信号通路上的基因(JAK2、STAT5A和STAT5B)。本研究使用了综合的研究方法,其目的如下：1)分析这些基因的SNPs与中国荷斯坦牛的血清细胞因子、乳房炎和产奶性状的关系；2)针对不同基因型和不同牛群中分析基因表达的差异；3鉴定乳房炎牛与健康牛的DNA甲基化水平差异,挖掘对奶牛乳房炎抗性遗传机制选择有效的标记基因。首先,通过DNA混池测序共发现60个SNPs,其中27个SNPs被用于468头奶牛群体的关联分析,进而对显著的SNPs进行mRNA表达量测定及启动子区CpG岛的DNA甲基化鉴定。本课题研究结果如下：1) JAK2基因：JAK2基因共发现5个新的SNPs。在这5个SNP中,两个SNP (SNP1A39652267G和SNP2A39645396G)位于外显子16和20,并且与人类多种白血病有关的功能突变位点(V617F)分别只有87和335个氨基酸的距离。这两个SNPs都为错义突变,分别具有将异亮氨酸突变为缬氨酸和将赖氨酸突变为天冬酰胺的功能,而另外3个SNPs (SNP3, SNP4和SNP5)位于3’侧翼区。关联分析的结果发现这5个SNPs与血清细胞因子和奶牛乳房炎显著相关,而mRNA的定量结果也与该结果一致,且高SCC/SCS的基因型具有较高的mRNA表达量。进行单倍型分析发现,JAK2基因的5个SNPs共有4个单倍型。对JAK2基因启动子的DNA甲基化测定发现,与健康牛相比,乳房炎牛的CpG岛存在高甲基化水平,而基因呈低水平表达。2) STAT5A基因：两个SNPs (SNP6A43046497C和SNP7G43047829A)位于STAT5A基因的内含子9上,其中SNP6与IL-6基因有关。对比IL-6基因的其它基因型,发现其野生基因型AA有较高水平,而且基因型AA的mRNA表达量也高于其它基因型。单倍型分析发现这两个SNPs位于一个LD上。DNA甲基化的结果表明,STAT5A启动子的CpG岛是高表达,而且与下调基因的表达有关。在STAT5A启动子区域的CpG岛上,存在两个活跃的转录因子。3) STAT5B基因：共发现3个SNPs,分别是SNP8G43047829A、SNP9A43673888G和SNPIO T43660093C。其中SNP8位于内含子4上,而SNP9和SNP10为首次发现,分别位于外显子16和19。SNP8和SNP9与血清细胞因子和奶牛乳房炎显著相关。与SNP8的其它基因型(AG和GG)相比,该SNP野生型AA基因型与低水平的SCC、SCS和IL-4相关。而SNP8的mRNA表达水平也与该结果相吻合。4)CD4：共检测到14个SNPS。在这14个SNP中,有11个SNP(从SNP11到SNP21)位于CD4基因的内含子和外显子上,而其它3个SNP (SNP22、SNP23和SNP24)位于启动子的2Kb区域。这11个SNP(从SNP11到SNP21)仅有2个单倍型,呈很强的连锁不平衡。关联分析结果发现,SNP22和SNP24与牛奶脂肪率有显著相关,而SNP23与SCC有关。对比于健康牛的DNA甲基化结果,乳房炎牛的CD4启动子区域的CpG岛有较低的甲基化和较高的mRNA表达水平。5)LAG3基因：LAG3基因共发现3个新的SNPs。其中SNP25(A104032765C)位于外显子4,而SNP26(C104028410T)和SNP27(C104028580A)位于3’侧翼区。SNP25为错义突变,能引起苏氨酸突变为脯氨酸。关联分析结果显示,SNP26和SNP27与血清细胞因子和产奶性状有显著相关。LAG3基因启动子区CpG岛无甲基化,因此对其启动子甲基化没有进一步分析。6)SNP与DNA甲基化联合分析：综合分析SNPs的关联分析结果及DNA甲基化水平：为更充分理解关于乳房炎抗性性状基因效应,我们整合了三项研究。在JAK2基因上的SNP1和SNP2, STAT5A上的SNP6及在CD4基因上处于连锁不平衡的11个SNPs均在mRNA的表达和DNA的甲基化上具有极显著的效应。此外,对于以上SNPs的SNP效应和DNA甲基化情况进行综合发现,以上SNPs对于乳房炎相关性状同样具有显著效应。对于相关性进行分析可知,CD4的甲基化水平与乳房炎性状之间存在显著的正相关。综上,这5个基因发现了显著的SNP,并且这些SNP可以作为奶牛乳房炎抗性遗传机制的候选标记。在JAK2、STAT5A和CD4基因中不同的甲基化表达水平和mRNA表达水平说明了这些基因在奶牛乳房炎调节中可能起到关键作用。关联分析、基因表达和甲基化分析共同表明JAK2、STATSA/B、CD4和LAG3基因可以作为奶牛乳房炎抗性的候选基因。