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第一部分免疫性血小板减少症患者外周血PBMCs中miRNAs表达谱检测本部分筛选出与免疫性血小板减少症(Immune Trombocytopenia,ITP)发病相关是的差异性表达的micro RNA(miRNAs)。首先,我们采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,再通过miRNAs芯片分析出不同分期ITP患者外周血单个核细胞中的miRNAs和mRNA表达谱。选取其中与ITP发病相关有明显差异性表达的miRNAs作为进一步的研究对象,并应用RT-PCR对选取的miRNAs表达情况进行验证。芯片结果显示,慢性组与健康对照组相比有216个表达上调的mi RNAs和150个表达下调的mi RNAs,慢性组与初诊组相比有55个表达上调的mi RNAs和45个表达下调的miRNAs。我们选择芯片结果中在ITP患者PBMCs内明显表达异常的miRNAs和文献报道的与免疫相关的miRNAs进行交叉检测,筛选出芯片中差异性表达升高的miR-148a作为研究对象。纳入在上海长海医院和解放军100医院确诊为初诊ITP的患者(n=21)及慢性ITP的患者(n=24),用同期入院体检人员作为健康对照(n=22),分离外周血单个核细胞,经RT-PCR检测miR-148a表达水平,结果显示,初诊、慢性ITP患者PBMCs中miR-148a的表达较健康对照组明显上调,且初诊与慢性ITP患者PBMCs中miR-148a之间的表达亦有差异,与mi RNA芯片检测的结果一致,表明芯片的结果可信。同时,我们运用酶联免疫吸附法(ELISA)检测不同分期ITP患者血浆中Th1及Th2相关细胞因子的表达。本部分结果提示,ITP患者存在特异性的miRNAs表达谱,且不同分期的ITP患者miRNAs表达亦存在差异,表明miRNAs可能参与了ITP发病进程,miR-148a在不同的分期ITP患者中表达不同,可以作为潜在的生物学标记物。同时我们的研究提示ITP患者外周血中存在Th1细胞极化状态。第二部分Mi R-148a在免疫性血小板减少症发病中的功能初探在第一部分研究中,我们筛选并验证了与ITP发病相关的miR-148a。在这一部分,我们将进一步阐明miR-148a在ITP发病中的可能作用机制。首先,我们通过生物信息学分析预测,结合第一部分的mRNA芯片数据,同时结合文献筛选出与免疫相关的mi R-148a的靶基因。其次,我们通过miR-148a mimics/inhibitors转染健康人原代PBMCs,采用RT-PCR验证miR-148a靶基因的表达情况。最后,运用miR-148a mimics/inhibitors转染ITP患者原代PBMCs后,行LPS刺激,通过RT-PCR验证Th1及Th2相关细胞因子表达情况。结果显示,内源性mi R-148a功能增强后,RelA的表达明显被抑制。相反,转染miR-148a inhibitors使miR-148a功能抑制后RelA的表达则显著上调。同时,miR-148a功能增强的PBMCs再经LPS刺激后,Th1相关细胞因子IL-8、IL-1b、TNF-a的水平均稍上调,而Th2相关细胞因子IL-4、IL-5、IL-10的水平均有明显的下降。mi R-148a功能受抑制的PBMCs再经LPS刺激后,Th1相关细胞因子IL-8、IL-1b、TNF-a的表达均轻微上调了,而Th2相关细胞因子IL-4、IL-5、IL-10的水平均有明显的升高。本部分结果提示,miR-148a可能通过RelA参与NF-κB信号途径,抑制Th2相关细胞因子的分泌,促进T细胞向Th1极化偏移,进一步参与ITP的发病进程。