第一章异基因间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮患者的疗效及机制研究第一节脐带MSC移植治疗难治性SLE患者的临床研究目的:探讨脐带间充质干细胞(umbilical cord derived mesenchymal stem cells,UC MSC)移植治疗难治性系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者的疗效及安全性。方法:多中心入组难治性活动期SLE患者40例,UC MSC来源于江苏省干细胞中心,所有患者分别于第0天及第7天经静脉输注UC MSC,每次输注细胞数1.0×106/kg体重,观察移植前后患者临床表现和实验室指标的变化。结果:39/40(97.5%)患者完成两次UC MSC移植治疗,1例患者(1/40,2.5%)因病情进展恶化未完成第二次MSC移植。12个月随访终点时患者生存率为92.5%(37/40),3例患者(7.5%)死于病情复发进展及难以控制的感染。12个月随访主要临床反应率(MCR)为32.5%(13/40),部分临床反应率(PCR)为27.5%(11/40)。分别有3例及4例患者在MSC移植治疗后9个月(3/24,12.5%)及12个月(4/24,16.7%)病情复发。BILAG评分移植后显著下降(1个月:5.35±4.48,3个月:5.28±4.71,6 个月:4.23±4.43,9 个月:3.85±4.73,12 个月:3.55±4.33,与移植前 10.78±6.09比,P 均<0.01)。SLEDAI 评分下降(移植前:10.83±4.63,1 个月:8.55±3.99,3 个月:7.43±3.93,6 个月:6.30±3.63,9 个月:6.40±3.84,12 个月:6.48±3.52,与移植前比,P均<0.01)。97.5%(39/40)患者有狼疮肾炎,肾脏系统BILAG评分改善,24小时尿蛋白定量移植后显著下降(移植前:2.24±1.43g,1个月:2.13±1.35g,3个月:1.91±1.20g,6 个月:1.65±1.11g,9 个月:1.24±1.09g,12 个月:1.41±1.33 g,与移植前比,9个月及12个月时P<0.05)。血清尿素氮及肌酐水平移植后6个月显著下降(与移植前比,P<0.05);同时,随着尿蛋白的改善,患者血清白蛋白水平移植后显著升高(移植前:31.72±7.47 g/L,1个月:36.99±5.83 g/L,3个月:38.00±6.69 g/L,6 个月:38.38±6.32 g/L,9 个月:38.92±6.38 g/L,12 个月:36.71±7.75 g/L,与移植前比,P均<0.001)。除肾脏系统外,患者皮肤及血液系统BILAG评分显著改善。血清补体C3和C4水平移植后上升,同时抗核抗体及抗双链DNA抗体水平下降。结论:UCMSC移植治疗难治性SLE患者安全有效。第二节CD8+T细胞-IFNy-IDO介导脐带MSC移植治疗SLE患者的机制研究目的:探讨脐带MSC移植治疗活动性SLE患者的机制。方法:体外分离SLE患者及健康者外周血单个核细胞(PBMC),CFSE标记法探讨脐带MSC抑制T细胞增殖的作用。分别用SLE患者及健康者活化的PBMC刺激脐带MSC,real-time PCR法检测MSC功能相关分子表达水平及差异。磁珠分选SLE患者及健康者外周血CD4+及CD8+T淋巴细胞,分别刺激脐带MSC,real-time PCR、western-blot及高效液相色谱仪检测吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)表达水平及活性,ELISA法检测上清细胞因子表达水平。体外共培养体系中加入细胞因子抑制剂或IDO抑制剂,进一步检测MSC IDO表达水平及抑制T细胞增殖能力的变化。Western-blot法检测T细胞刺激MSC表达IDO的具体信号通路。在脐带MSC移植治疗活动性SLE患者的临床研究中,进一步分析临床反应与患者基线血清细胞因子表达水平之间的相关性。结果:体外脐带MSC可显著抑制SLE患者及健康者T细胞增殖。SLE患者活化的PBMC可诱导MSC表达TGF-β1、IDO、HGF及IL-6,以IDO水平升高最为显著(>200倍)。体外在MSC与SLE PBMC共培养体系中加入IDO抑制剂可显著逆转MSC对T细胞增殖的抑制。SLE患者CD8+T淋巴细胞可显著刺激脐带MSC表达IDO,上清中IFN-y水平显著升高。在MSC与SLECD8+T细胞共培养体系中加入抗IFN-γ单克隆抗体可有效抑制MSC表达IDO,并显著消除MSC对T细胞的增殖抑制作用。SLE患者CD8+T细胞表达高水平的IFN-γ,通过IFNGR/JAK/STATS通路刺激MSC表达IDO。而SLE患者骨髓来源MSC对异体CD8+T细胞及重组人IFN-γ反应差,不能表达高水平IDO及有效抑制T细胞增殖。通过对接受脐带MSC移植治疗的SLE患者分析发现,临床有反应的患者基线血清IFN-γ水平显著高于无反应的患者,血清IL-6水平显著下降,而IL-17、TNF-α及TGF-β水平两组间无显著差异,同时发现对MSC治疗有反应的患者基线CD8+T细胞比例及绝对数均显著高于无反应患者。结论:CD8+T淋巴细胞-IFN-γ-IDO轴在脐带MSC移植治疗SLE患者中发挥重要作用,揭示了脐带MSC治疗SLE患者有效的新的机制。第二章脐带MSC移植治疗系统性硬化症患者的疗效及机制研究目的:探讨脐带间充质干细胞(UC MSC)移植治疗难治性系统性硬化症(Systemic sclerosis,SSc)患者的疗效及机制。方法:入组5例SSc患者,均符合SSc分类诊断标准,给予UCMSC移植治疗,经静脉输注细胞数1×106/kg体重,评价患者移植前及移植后各时间点的临床表现及实验室检查指标的改变,并探讨可能的治疗机制。结果:5例SSc患者病程24～250个月,行UCMSC移植治疗后患者无移植相关不良反应。UCMSC移植后患者皮肤厚度评分(MRSS)显著下降,生活质量评分(HAQ-DI)改善,血清抗核抗体水平下降,伴有血管炎及难治性皮肤溃疡的患者移植后皮肤溃疡显著好转。此外,机制方面的研究发现,UC MSC移植后SSc患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例增加,血清TGF-β水平升高,而外周血CD3+T细胞尤其是CD4+T细胞亚群绝对数减少。进一步研究发现UC MSC体内外均可诱导SSc患者T淋巴细胞凋亡,而SSc患者骨髓来源MSC表达Fas、FasL及MCP-1水平均显著下降,不能诱导T细胞凋亡。结论:UC MSC移植治疗SSc患者安全且有较好的临床疗效,可通过诱导宿主CD4+T淋巴细胞凋亡上调TGF-β及Treg诱导宿主免疫耐受。第三章脐带MSC移植治疗原发性干燥综合症患者的疗效及机制研究目的:探讨脐带间充质干细胞(UC MSC)移植治疗原发性干燥综合症(primary Sj ogren’s Syndrome,p S S)患者的疗效及机制。方法:入组24例pSS患者,均符合干燥综合症分类诊断标准,给予UC MSC移植治疗,经静脉输注细胞数1×106/kg体重,评价患者移植前及移植后各时间点的临床表现及实验室检查指标,并探讨可能的治疗机制。结果:24例pSS患者行UC MSC移植治疗后无移植相关不良反应。UC MSC移植后口干眼干等临床症状明显缓解,干燥综合症疾病损伤指数(Sjogren’s Syndrome Disease Damage Index,SSDDI)移植后下降(移植前:5.63 ±1.44,1 个月:4.33 ±1.79,3个月:4.08±1.44,6个月:3.46±1.18,12个月:3.08±1.21,与移植前比,P均<0.05)):疾病活动指数(Sjogren’s Syndrome Disease Activity Index,SSDAI)移植后改善。静态唾液流率移植后2周即有显著改善(2周:1.00 ±0.78 ml/10 min,基线:0.63 ± 0.73 ml/10min,P<0.001,n=1 1),移植后1个月较移植前上升2倍(1.26± 1.02 ml/10min,与移植前比P<0.001),并在后续随访过程中维持稳定。动态唾液流率移植后显著升高(与移植前比,P均<0.05)。视觉模拟评分(VAS),口干量表评分(TESS)在随访2周、1个月及3个月时明显降低,并有显著差异。腮腺造影提示移植后12个月患者唾液腺充盈及排空功能均改善。此外,pSS并发的肝功能异常及血液系统受损在移植后均有显著改善。UC-MSC移植后1个月患者血清抗SSA/Ro抗体水平下降(移植前:84.76 ± 62.19 U/ml,1个月:0.51 ± 0.22U/ml,P<0.001);抗 SSB/La 抗体水平下降(移植前:146.62 ± 83.08 U/ml,1 个月:52.61±38.67U/ml,P<0.001),且血清球蛋白水平显著下降。机制方面的研究发现UC MSC移植后患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg 比例升高而CD3+CD8-IL-17A+Th17细胞比例下降,血清TGF-β升高而IL-17下降。结论:UC MSC移植治疗对pSS患者患者安全且有较好的临床疗效,可能通过调节Treg/Th17细胞平衡发挥治疗作用。第四章异基因MSC移植治疗难治性多发性肌炎/皮肌炎的临床研究目的:探讨异基因MSC移植治疗难治性多发性肌炎(polymyositis,PM)/皮肌炎(dermatomyositis,DM)患者的疗效及安全性。方法:10例DM/PM患者(DM 4例,PM 6例),女9例,男1例,年龄19～44岁,病程6～60月(平均7.5月),均符合Bohan及Peter 1975年提出的DM/PM分类诊断标准,所有患者均对大剂量激素及足疗程免疫抑制剂治疗无效,或伴有严重并发症如间质性肺炎、难治性皮肤溃疡。3例患者接受异基因骨髓来源MSC移植,其中2例患者移植后病情复发,分别再次给予脐带来源MSC移植,另7例患者均给予一次脐带MSC移植,每次经静脉输注细胞数1.0×106/kg体重,观察移植前后患者临床及实验室指标,评价移植疗效及安全性。结果:10例患者移植后随访7～24月,平均17月,均无移植相关死亡及并发症。移植后6个月,患者血清肌酸激酶(CK)持续下降(移植前:2380.0±673.8U/L;1月:1027.0±266.7U/L;2 月:486.2±143.1U/L;3 月:92.9±19.5U/L;6 月:248.8±135.6U/L,与移植前比,P均<0.05);6例患者移植后12月CK降为106.0±39.4U/L。血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)同步下降(移植前:145±45U/L;1月:96±34U/L;2月:67±22U/L;3 月:28±5U/L;6 月:36±10U/L,与移植前比,P 均<0.05)。患者总体生活质量评分(VAS)及手工肌力评分(MMT)较移植前明显改善。MRI提示股四头肌处炎症信号较移植前显著减少。6例患者伴有间质性肺炎,移植后复查肺部高分辨CT提示炎症改变较前有不同程度吸收,肺功能改善。1例患者伴有双膝及双肘难治性皮肤溃疡,移植后溃疡面渗出减少,新生肉芽组织长出,6月后溃疡基本愈合。3例患者分别于移植后第6,8,8个月病情复发,2例患者接受第二次MSC移植,均有临床疗效。随访过程中,两例患者分别于移植后11个月及6个月死于病情复发及严重感染,与MSC移植治疗无关。结论:异基因MSC移植治疗难治性DM/PM患者安全有效,且部分患者对重复MSC输注有效,其长期疗效及安全性有待进一步随访观察。