研究背景肿瘤细胞有别于正常细胞的主要特性是生命力强、无限增殖、无接触抑制性并且具有局部浸润和迁移远端的能力,特别是恶性肿瘤的侵袭特性,其对远端组织器官的侵袭破坏往往是恶性肿瘤导致患者死亡的关键原因。常规的肿瘤治疗策略对控制原位肿瘤的增殖生长能够起到一定的作用,但是对肿瘤细胞迁移侵袭能力的抑制任然十分有限。肿瘤转移是多种转移相关因子共同作用的结果,恶性瘤细胞转移早期的重要事件就是对细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)的降解,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)可以水解不同类型的胶原蛋白、纤粘连蛋白、层粘连蛋白,在ECM降解,瘤细胞侵袭转移中发挥重要作用。MMP-9是MMP家族的主要成员,也称为明胶酶B,水解基底膜中的Ⅳ型胶原,刺激肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭和转移,甚至能通过调节血管内皮生长因子(VEGF)来调节肿瘤血管生成。恶性黑色素瘤(malignant melanoma, MM)是免疫原性最强的肿瘤之一,是研究免疫治疗、基因治疗的首选肿瘤模型。第一例恶性肿瘤的基因治疗就针对于晚期黑色素瘤。Rosenberg小组将肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)基因经逆转录病毒载体在体外转染来进行晚期黑色素瘤的治疗。RNA干扰(RNAinterference, RNAi)是有效双链RNA引起的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)现象,为抑制mRNA分子合成蛋白提供了快速而相对简便的途径。伴随RNAi技术的完善,RNAi技术已经运用于肿瘤的基因治疗。因此,本研究使用RNAi技术靶向沉默小鼠黑色素瘤B16细胞中的MMP-9,理论上具有抑制肿瘤增殖转移的可行性。研究目的1.筛选B16细胞MMP-9基因干扰序列；2.探究体外干扰MMP-9对B16小鼠黑色素瘤细胞侵袭转移的影响；3.体内研究干扰MMP-9对C57BL/6小鼠恶性黑色素瘤侵袭转移的影响。研究方法1.针对小鼠MMP-9寻找干扰靶位点,针对靶位点设计shRNA干扰序列,用pGensil-1质粒为基本质粒结构,在其U6 Promoter和CMV Promoter之间插入针对MMP-9的不同RNA干扰序列,构建干扰载体。使用阳离子复合物转染试剂将干扰载体转染进入B16细胞,流式细胞技术测定转染效率,激光共聚焦显微镜观察细胞形态及荧光表达情况,实时荧光定量PCR方法检测每种载体的干扰效果,优选干扰载体；2.使用优选的MMP-9干扰载体在体外水平干扰B16细胞的MMP-9,Western blotting实验检测细胞表达MMP-9蛋白变化,Transwell实验检测干扰MMP-9后B16细胞迁移能力、侵袭能力的变化；3.以小鼠爪垫皮下移植法建立C57小鼠黑色素瘤侵袭模型,继而采用局部瘤体注射针对MMP-9基因的RNA干扰复合物给予病鼠基因治疗,评估治疗效果。研究结果1.构建了p-9-RNAi-1#,2#,3#三种干扰载体。在转染效率保证的基础上,定量PCR检测表明2#载体在24h到48h整个过程中表现出持续的干扰效力并呈现出上升趋势,从32%到达63%,是三者中最优干扰载体；2.RNAi沉默MMP-9后,实验组与对照组MMP-9蛋白质水平没有检测到明显的差异性,但是体外迁移侵袭中干扰组的迁移侵袭能力明显下降；3.对小鼠足垫模型原位瘤给予局部瘤体注射MMP-9干扰质粒后肿瘤转移受到抑制。研究结论实验表明2#载体是最为有效的干扰载体,可以在体外水平有力下调小鼠黑色素瘤B16细胞MMP-9的mRNA表达,抑制细胞的迁移力、侵袭力；在体内水平可以对肿瘤的生长起到明显抑制作用。