【研究目的】观察染矽尘大鼠矽肺发生不同时期肺组织自噬水平的变化,探讨自噬在矽肺发生中的作用及其机制。【研究方法】通过建立矽肺大鼠模型,观察自噬在矽肺发生不同时间点的变化。SPF级Wistar雄性大鼠72只,8周龄,被随机分为矽肺模型组和溶剂对照组。模型组大鼠采用非暴露式气管滴注法一次性给予SiO₂悬浮液建立矽肺模型,溶剂对照组大鼠给予等量0.9%的Nacl溶液。每天观察大鼠一般情况并记录体重。于造模后1、7、14、21、28、60天各处死6只大鼠,取肺组织,称量肺湿重,计算肺脏器系数;通过HE和Masson染色观察肺组织病理变化和纤维化程度;利用酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测肺组织匀浆中转化生长因子β（TGF-β）、白介素1（IL-1）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平;利用Western blot法检测肺组织中自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（Microtubules associated protein 1 light chain 3,LC3）和酵母自噬相关基因6（Beclin1）的表达水平;利用透射电镜观察大鼠肺组织自噬体数量。为进一步明确自噬在矽肺发生中的作用,分别用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）和自噬激动剂雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）进行干预,观察矽肺大鼠纤维化的进展。将168只SPF级Wistar雄性大鼠随机分矽肺模型组（S组）、SiO₂+Rapa组（R组）、SiO₂+3-MA组（M组）和溶剂对照组（C组）,造模方法同上。R组和M组大鼠在SiO₂暴露前两天分别腹腔注射Rapa 1mg/kg/d、3-MA 2.5mg/kg/d,造模后隔天腹腔注射。于造模后第1、7、14、28、35、45、60天各处死6只大鼠,取肺组织,观察检测方法同上。并利用Western blot法检测肺组织中上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白Vimentin、α-SMA的表达水平。将人单核细胞（THP-1）和人肺泡上皮细胞（A549）共培养,并通过SiO₂刺激,探讨肺泡上皮细胞EMT转化的可能机制。将THP-1细胞用100ng/ml的佛波酯（PMA）诱导分化成巨噬细胞,并分为四组,溶剂对照组（C组）、SiO₂处理组（S组）、SiO₂+Rapa组（R组）和SiO₂+3-MA组（M组）。S组仅用SiO₂（100μg/ml）处理24h,R组和M组分别先用Rapa（100nM）和3-MA（5mM）预处理细胞2h,再加入SiO₂（100μg/ml）后培养24h,C组正常培养。24h后,将各组THP-1细胞放入0.4μm孔径的Transwell小室,并将3×10⁴/ml A549细胞接种于小室,再共培养24h。利用CCK-8检测巨噬细胞和A549细胞存活率,判断SiO₂和自噬干预剂对细胞有无毒性作用;收集巨噬细胞上清液,利用ELISA法检测TGF-β的浓度;分别收集巨噬细胞和A549细胞并提取蛋白,利用Western blot法检测巨噬细胞自噬相关蛋白LC3、Beclin1、P62以及A549细胞EMT相关蛋白Vimentin、α-SMA和E-cad的表达水平。【研究结果】1.大鼠一般情况及体重对照组（C组）大鼠实验期间一般状况良好;模型组（S组）大鼠在实验14天开始出现被毛蓬乱,活动性差,呼吸急促并伴有湿啰音;M组大鼠一般情况与S组相似,肺部湿啰音比S组加重;R组大鼠在实验14天开始也出现被毛蓬乱,活动性较S组更差,仍呼吸急促但湿啰音比S组轻。S、M和R组大鼠体重在实验第7天后均显著低于C组（P<0.05）;R组大鼠体重在实验第45天开始明显低于S组（P<0.05）。2.大鼠肺脏器系数S、M和R组大鼠肺脏器系数在实验第7-60天均显著高于C组（P<0.05）;M组在实验第7-60天显著高于S组和R组（P<0.05）;R组在实验第60天显著低于S组（P<0.05）。3.大鼠肺脏大体解剖观察结果C组大鼠各时间点双肺呈现粉红色,表面光滑,弹性好;S组大鼠双肺在实验后第1天呈现粉红色,表面偶有渗血点,质软,第14天开始双肺逐渐呈现粉白色,表面可见灰白色斑点结节、质硬;M组大鼠双肺灰白色斑点结节较S组分布更广泛;R组大鼠双肺灰白色斑点数量少于S组,质软。4.大鼠肺组织病理检查结果HE染色表明,C组大鼠第1天可见轻度炎细胞浸润,第14天恢复正常,肺组织结构正常;S组在实验第1-14天,肺泡壁增厚,肺间质可见炎性细胞浸润,为中度肺泡炎,第21天肺组织可见少量炎性结节,至第60天出现结节融合,且各时间点炎性评分均显著高于C组（P<0.05）;M组各时间点炎性评分均显著高于S组（P<0.05）;R组各时间点炎性评分均显著低于S组（P<0.05）。Masson染色表明,C组肺组织未见明显胶原纤维;S组在实验第14天开始出现少量胶原纤维增生,为轻度纤维化,第28天时达到中度纤维化,至第60天可见大量胶原纤维,纤维化评分接近3分;且第14-60天评分均显著高于C组（P<0.05）;M组第14-60天评分均显著高于S组（P<0.05）;R组第14-60天评分均显著低于S组（P<0.05）。5.大鼠肺组织中IL-1、TNF-α和TGF-β水平变化ELISA结果显示,S组大鼠肺组织匀浆中IL-1、TNF-α和TGF-β的表达水平均显著高于C组（P<0.05）;M组3种炎性因子的表达水平均显著高于S组（P<0.05）;R组大鼠3种炎性因子的表达水平均显著低于S组（P<0.05）。6.大鼠肺组织自噬相关蛋白LC3和Beclin1的水平变化Western blot测定结果显示,S组大鼠肺组织LC3II/LC3I的比值总体呈下降趋势,且在第1-60天显著高于C组（P<0.05）;R组LC3蛋白在第14天、28天和60天时均显著高于S组（P<0.05）;M组LC3II/LC3I的比值在第14天、28天和60天时均显著高于C组,但低于S组（P<0.05）。S组大鼠肺组织Beclin1蛋白表达水平总体呈下降趋势,且在第7-60天显著高于C组（P<0.05）;R组Beclin1蛋白在第14天、28天和60天时均显著高于S组（P<0.05）;M组Beclin1蛋白在第14天、28天和60天时均显著高于C组,但低于S组（P<0.05）。7.大鼠肺组织EMT相关蛋白Vimentin和α-SMA的水平变化Western blot测定结果显示,S组大鼠肺组织Vimentin和α-SMA蛋白表达水平总体呈上升趋势,在第14-60天均显著高于C组（P<0.05）;M组在第14-60天均显著高于S组（P<0.05）;R组在第14-60天均显著低于S组（P<0.05）。8.巨噬细胞和A549细胞存活率的测定SiO₂和自噬干预剂刺激培养24小时后,CCK-8结果显示两种细胞的存活率均在90%以上。9.巨噬细胞自噬相关蛋白LC3、Beclin1和P62的表达水平巨噬细胞与A549细胞共培养24小时后,收取巨噬细胞并提取总蛋白,Western blot实验结果显示,SiO₂处理组LC3II/LC3I的比值和Beclin1表达水平显著高于对照组,P62显著低于对照组（P<0.05）。与SiO₂处理组相比,3-MA的干预明显抑制了自噬的活性,表现为LC3II/LC3I的比值和Beclin1的表达显著降低,同时P62蛋白累积水平显著增加（P<0.05）;Rapa的干预明显促进了LC3II/LC3I的比值和Beclin1水平的升高,同时P62的降解显著增加（P<0.05）。10.巨噬细胞上清液中TGF-β的表达水平巨噬细胞与A549细胞共培养24小时后,收集巨噬细胞培养上清,ELISA法检测TGF-β水平,结果表明,SiO₂处理组细胞上清的TGF-β水平显著高于对照组（P<0.05）;与SiO₂处理组相比,3-MA的干预显著促进了SiO₂诱导的TGF-β水平的上调（P<0.05）;而Rapa的干预显著抑制了SiO₂诱导的TGF-β水平的上调（P<0.05）。11.A549细胞EMT相关蛋白E-Cad、Vimentin和α-SMA的表达水平巨噬细胞与A549细胞共培养24小时后,收取A549细胞并提取总蛋白,Western blot实验结果显示,与不同处理组大鼠肺组织Vimentin和α-SMA的蛋白表达变化相似,SiO₂处理组A549细胞的Vimentin和α-SMA水平显著高于对照组,E-Cad水平显著低于对照组（P<0.05）;与SiO₂处理组相比,3-MA的干预显著促进了TGF-β诱导的A549细胞Vimentin和α-SMA水平的上调和E-Cad水平的降低（P<0.05）,促进了EMT过程;而Rapa的干预显著抑制了TGF-β诱导的A549细胞Vimentin和α-SMA水平的上调和E-Cad水平的降低（P<0.05）,抑制了EMT过程。【研究结论】1.染矽尘大鼠肺组织自噬水平随矽肺发病阶段不同变化,在矽肺发生早期炎性反应中自噬水平升高,随着矽肺纤维化程度的加重自噬水平逐渐降低。2.利用Rapamycin增强自噬后可以抑制矽肺大鼠肺组织炎性反应并减轻纤维化程度,但是长期使用Rapamycin具有一定的毒副作用。3.Rapamycin与SiO₂联合处理THP-1诱导转化后的巨噬细胞,增强细胞自噬水平后可能通过降低TGF-β表达水平,进而抑制A549细胞EMT过程。