γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)是一种四碳非蛋白氨基酸，广泛分布于植物、动物、藻类、真菌和细菌中，具有降血压、调节神经紊乱、抗惊厥、提高记忆力等重要的生理功能。谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD; EC 4.1.1.15)是生物合成法制备GABA的关键酶。在辅酶5’-磷酸吡哆醛(PLP)存在的条件下，GAD能特异性不可逆地催化L-谷氨酸(L-Glu)脱羧生成GABA。天然GAD具有催化活力低和稳定性差等缺点。因此，对GAD进行分子改造以提高其催化性能具有重要意义。本研究选取短乳杆菌(Lactobacillus brevis)GAD为父本酶，以提升其热稳定性和活性为目标，利用序列一致性及优化蛋白表面电荷两种理性设计方法改善了其催化性能。主要研究内容及其结果如下：
　　运用共识发现器(http://cbs-kazlab.oit.umn.edu)，检测到8个GAD同源家族中氨基酸频率出现较高的位点。随后，利用定点突变技术对8个残基进行一致突变，获得8个突变体：D45Y、Q156K、I159L、A163S、D179E、H181R、T383K和T408A。酶学性质分析显示，突变体H181R的Km虽然与父本酶接近，但其kcat/Km(0.99 s-1·mM-1)是父本酶(0.79 s-1·mM-1)的1.25倍；与父本酶的半失活温度T5015(56.21℃)、55℃下的半衰期t1/2(24.05 min)和热解折叠温度Tm(40.63℃)相比，突变体T383K的T5015、t1/2和Tm分别增加了2.99℃、17.72min和1.26℃。结合分子动力学模拟与分子间相互作用分析，突变体T383K具有相对较低的RMSD，且残基Thr383与Arg388分子间增加了1个氢键，可能是导致其稳定性提高的主要原因。
　　根据上述研究结果，选取H181和T383为潜在位点，设计饱和突变引物并构建突变文库。采用基于溴甲酚紫(BCP)比色法的高通量筛选方法，获取了3个催化活力和稳定性均得到提升的突变体H181K、T383V和T383G。研究显示，与父本酶相比，突变体H181K、T383V和T383G的kcat/Km分别是父本酶的1.30倍、1.53倍和1.30倍；同时，突变体H181K、T383V和T383G的T5015分别提高至56.95℃、58.75℃和58.07℃；而t1/2则分别为父本酶的1.42倍、1.67倍和1.66倍；此外，突变体H181K、T383V和T383G的Tm较父本酶分别提高了0.43℃、1.17℃和0.37℃。
　　利用Linux系统的ETSS程序，基于带电氨基酸残基i点和j点之间的电荷-电荷相互作用能(Eij)，预测GAD表面影响其稳定性的潜在残基，获得3个关键位点(E14、D54和E114)，并利用定点突变技术获得6个突变体E14A、E14R、D54A、D54K、E114A和E114K。结果显示，突变体D54A的kcat/Km(1.42 s-1·mM-1)是父本酶(0.79 s-1·mM-1)的1.80倍；同时，与父本酶的半失活温度T5015(56.21℃)、55℃条件下的半衰期t1/2(24.05 min)和热解折叠温度Tm(40.63℃)相比，突变体D54A的T5015、t1/2和Tm分别增加了3.95℃、271.89min和4.80℃。
　　本研究通过序列一致性突变和优化蛋白表面电荷两种理性设计方法，预测出对GAD催化性能起关键作用的潜在位点，并成功地筛选到稳定性与催化活性提高的突变体。本研究不仅强化了序列一致性和优化蛋白表面电荷是改善GAD催化性能的有效策略，同时也为其它酶催化性能的改造提供了借鉴。