目的:胃癌是我国发病率和病死率均居前列的常见恶性肿瘤。流行病学统计显示目前世界上罹患胃癌的总体生存(包括无瘤生存及带瘤生存)率约为20-25%。全球中每年胃癌的新发生病例数在100万以上,其中有40%左右的病例发生在我国,而且其患病率和病死率均是世界平均水平的2倍以上。另外胃癌的预防和治疗均需要得到高度重视,因为新发病例人群有年轻化的趋势。尽管胃癌相关的发生发展的病理生理机制以及诊疗策略正在逐年进步,但是胃癌在治疗上仍还面临着众多问题(包括诊断滞后、复发转移及预后不良等)。我们应该积极探索胃癌发生、发展的机制,寻找到有助于转移高危个体预测和早期临床诊断的分子标志物,从而确立新的治疗靶点,此对提高对胃癌的疗效具有特殊重要意义。多种癌细胞具有的共同恶性表型包括无限的细胞增殖、回避凋亡、组织侵袭及转移等。在细胞水平的层次上可能发生的一系列的增殖失调成为许多癌症疾病发生发展的基础。溶酶体的主要作用是协调细胞内稳态,其主要参与胞内胞吞、胞吐以及自噬等生物学行为。有研究报道在肝细胞凋亡进程中溶酶体膜通透性(LMP)改变从而参与了对凋亡的调控。溶酶体内酶类在凋亡进程中的释放具有选择性。在溶酶体膜通透性较小条件下有少量酶(选择性)被释放入胞浆中引起细胞凋亡;而在膜通透性很大条件下则大量的酶(非选择性)被释放出来而引起细胞死亡。所以LMP水平高低可以决定不同形式的细胞死亡。还有学者证实了溶酶体的确参与细胞凋亡过程,且认为其方式是通过释放其内的组织蛋白酶(Cathepsins,CTS)来达到的。而且溶酶体内CTS在多种细胞凋亡中也发挥了重要作用,并且已经成为生物医学领域研究的热点。CTS是一种能裂解肽键的酸性蛋白水解酶,且多种肿瘤细胞的溶酶体合成及分泌CTS效率增加,活性提高,分布改变。尤其是其能直接或是间接的促进其它酶类对细胞外基质的多种成分发生降解,此对于肿瘤恶性演进及肿瘤细胞侵袭转移进程有重要意义。组织蛋白酶F(CTSF)属半胱氨酸蛋白酶类。一般情况下,成熟型CTSF分子大部存在于溶酶体内部;其可参与细胞内众多蛋白质代谢、细胞凋亡进程(通过降解细胞外基质和及蛋白多糖)。已有研究表明:和正常组织相比,CTSF在小儿多种脑胶质瘤组织中表达水平降低,而在宫颈癌组织中表达水平升高,且在乳腺癌组织中表达与蛋白降解组成分密切相关。这说明CTSF在不同的恶性肿瘤疾病中的作用和意义可能存在明显差异。本研究首先通过检测胃癌患者肿瘤组织以及多种人胃癌细胞株中CTSF基因的表达水平的高低,而后结合临床病理指标以及随访预后资料,进一步探讨CTSF不同表达水平的临床意义;明确和正常的胃组织及胃正常粘膜细胞株相比,人胃癌组织及细胞株中CTSF表达水平是具有不同程度下降的。然后挑选CTSF表达水平相对较高的人胃癌细胞株再使用慢病毒感染沉默CTSF表达水平后检测多种人胃癌细胞株的恶性生物学行为变化。而后使用人mRNA全基因组表达谱芯片高通量筛选CTSF基因所调控的下游重要基因指标后进行WB验证。同时应用生物学分析其上下游分子互作及网络,用以进一步阐述明CTSF在胃癌中的作用及其相关信号通路的可能分子调控机制。研究方法:1、CTSF在胃癌组织中的表达水平及临床资料特征相关性分析。(1)免疫组化方法检测109对胃癌及相应正常胃组织中CTSF的表达水平,QT-PCR和Western blot分析44对胃癌及相应正常胃组织中CTSF基因mRNA和蛋白表达水平;(2)依据109对IHC的结果分析CTSF表达水平高低与胃癌患者临床病理特征之间是否存在相关性;(3)QT-PCR和Western blot检测6种人胃癌细胞株CTSF的表达情况。2、CTSF对胃癌的生物学行为的影响。(1)QT-PCR和Western blot检测慢病毒转染后人胃癌细胞株敲减CTSF效率,筛选出合适靶点的慢病毒;(2)通过体外慢病毒载体感染构建CTSF低表达人胃癌细胞株沉默CTSF表达后通过CCK8、流式细胞凋亡实验及Transwell实验检测CTSF对人胃癌细胞株增殖、侵袭、迁移能力的影响;并且应用Western blot检测EMT相关蛋白变化。3、研究CTSF调控下游靶基因及其相关分子信号通路、网络。(1)首先利用人mRNA全基因组表达谱芯片技术高通量筛选出CTSF可能调控的下游靶基因指标,然后对其中候选靶基因在感染后干扰CTSF表达的人胃癌细胞株SGC-7901中进行Western blot验证;(2)应用IPA软件进行生物学信息分析预测CTSF上下游网络及分子互作关系;(3)Western blot检测CTSF对人胃癌细胞株SGC7901在增殖、凋亡、迁移侵袭的调控通路关键蛋白PIK3R3、AKT、p21和Cyclin D1表达水平的影响。结果:1、CTSF在人胃癌组织中表达水平明显低于正常胃粘膜组织,且与胃癌侵袭深度、淋巴结转移、远处转移及临床分期及预后相关。(1)CTSF在胃癌组织中表达水平与相应正常胃粘膜组织比较则明显下调(P<0.01);(2)CTSF低表达水平组具有更高的侵袭深度及胃周淋巴结转移率、远处转移率及临床分期及预后密切相关(P<O.05),而与性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、肿瘤分化等临床病理指标不具有相关性;(3)CTSF在正常胃粘膜细胞株GES-1及各人胃癌细胞株中均有表达,并且和GES-1相比所有人胃癌细胞株中CTSF表达水平较低。2、体外实验证实敲减CTSF促进胃癌的生长和转移。(1)QT-PCR和Western blot筛选出最合适的慢病毒靶点后建立稳定转染后敲减CTSF的人胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823和MKN45;(2)敲减CTSF能明显促进人胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823及MKN45增殖,抑制凋亡,提高迁移侵袭能力,而且改变EMT特征蛋白表达水平;3、CTSF可能调控多个重要下游基因,而且可能调控了PI3K/AKT信号通路。(1)筛选出CTSF下游可能调控的基因指标:在人胃癌细胞株SGC-7901中发现1117个上调基因,1143个下调基因(倍数>1,P<0.05);(2)经Western blot验证了包括差异显著的基因,变化趋势与芯片结果基本一致;(3)Western blot检测PIK3R3、pAKT、AKT、p21和CyclinD1蛋白水平,发现沉默CTSF可以激活PI3K/AKT信号通路;此很有可能是胃癌发生发展过程中一个重要分子机制。结论:1、和癌旁正常胃粘膜组织相比较,CTSF在胃癌组织表达明显降低。CTSF随着肿瘤侵袭深度、淋巴结转移及远端转移、临床分期及预后的进展表达水平随之降低;而与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置及肿瘤分化程度没有明确相关性。和正常胃粘膜细胞相比较,CTSF在多种人胃癌细胞株中表达明显下调。提示CTSF是胃癌发生发展中一个有意义的分子靶标。2、通过CCK8、流式凋亡实验及Transwell等体外实验,证实靶向干扰敲减CTSF的表达水平,可以降低人胃癌细胞株的凋亡水平,同时提高增殖、迁移及侵袭的能力。3、进一步探讨CTSF在胃癌发生发展进程中的作用机制,筛选CTSF调控的众多下游靶基因。此可以为胃癌临床诊治提供新靶点。