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研究目的:通过检测T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphoma invasion andmetastasis 1,Tiam1)在胰腺癌组织标本中的表达水平,分析其与患者临床病理参数之间的相关性,并进一步通过体内外实验阐明Tiam1在胰腺癌细胞增殖、转移与侵袭过程中的作用及可能的分子机制,为Tiam1作为胰腺癌临床治疗的新靶点提供理论和实验依据。材料与方法:1.数据库及胰腺癌组织标本分析:通过Human Protein Atlas(HPA)数据库和Oncomine数据库检索Tiam1蛋白和mRNA在胰腺癌组织中的表达;免疫组织化学染色法检测Tiam1在胰腺癌组织与癌旁正常组织中的表达,卡方检验分析其表达与患者临床病理参数之间的相关性;采用Kaplan-Meier生存曲线和Cox比例风险模型分析Tiam1的表达在胰腺癌患者临床预后评估中的意义。2.体外实验:蛋白免疫印迹实验检测Tiam1蛋白在多种人胰腺癌细胞系中的表达情况,筛选出高表达Tiam1的胰腺癌细胞系进行后续实验。应用小干扰RNA(siRNA)技术沉默细胞BxPC-3和SW1990中Tiam1基因,蛋白免疫印迹实验检测细胞中Tiam1的表达验证沉默效果。免疫荧光实验检测Tiam1在细胞的蛋白定位;集落形成实验检测Tiam1基因沉默对细胞增殖能力的影响;划痕愈合实验和Transwell小室实验检测Tiam1基因沉默对细胞迁移与侵袭能力的影响;蛋白免疫印迹实验检测Tiam1基因沉默对细胞EMT相关标志物及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的影响。3.体内实验:胰腺癌细胞BxPC-3经转染处理沉默Tiam1基因后,皮下注射接种在裸鼠右侧腋窝处,建立胰腺癌移植瘤模型,检测Tiam1基因沉默对移植瘤形成及瘤体生长情况的影响;裸鼠处死后,取瘤称重;进一步通过苏木素-伊红(HE)染色实验观察移植瘤组织的病理学结构;免疫组化实验测定移植瘤组织中增殖相关蛋白Ki-67,EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、Slug的表达水平。结果:1.Tiam1在胰腺癌组织中高表达,且与胰腺癌患者不良预后密切相关:HPA数据库和Oncomine数据库检索发现,在胰腺癌组织中Tiam1蛋白和mRNA表达均升高;免疫组化结果表明,Tiam1蛋白在细胞核与细胞浆中均有表达,其在胰腺癌组织的阳性率(92.59%)与癌旁组织的阳性率(37.04%)相比显著升高(P<0.05);卡方检验结果表明,Tiam1蛋白与淋巴结转移、病理分级密切相关(P值分别为0.031,0.040),而与患者其他临床病理因素无相关性(P值均>0.05);生存分析结果显示,Tiam1高表达的胰腺癌患者总生存期较Tiam1低表达的患者生存期明显缩短(P<0.05);Cox回归模型分析结果显示,Tiam1表达是提示胰腺癌患者不良预后的独立风险因素;2.沉默Tiam1显著抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭:免疫荧光结果表明,Tiam1蛋白定位于胰腺癌细胞的胞核与胞浆,主要在胞核中表达,与免疫组化结果相一致;集落形成实验结果表明,与对照组相比,Tiam1敲低组细胞的集落形成能力明显降低(P<0.05);划痕愈合实验和Transwe11小室实验结果表明,Tiam1敲低能够显著降低细胞的横向、纵向迁移能力与侵袭能力(P值均<0.05);蛋白免疫印迹实验结果表明,Tiam1敲低可上调上皮标志物E-cadherin,下调间质标志物Vimentin和相关转录因子Snai1、S1ug的蛋白表达(P值均<0.05),同时降低PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白p-mTOR、p-Akt和p-S6的表达(P值均<0.05);3.沉默Tiam1显著抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长:裸鼠皮下成瘤实验结果表明,敲低Tiam1基因可抑制移植瘤的形成,同时降低裸鼠肿瘤的体积和重量(P值均<0.05);HE染色结果显示,与对照组比较,Tiam1沉默组肿瘤组织中细胞出现皱缩、片状坏死等病理性改变;免疫组化结果表明,Tiam1沉默后,移植瘤组织中Ki-67、Vimentin、Slug的表达下调,而E-cadherin的表达上调。结论:1.Tiam1蛋白表达在胰腺癌组织中显著升高,且其高表达预示患者的不良预后。2.Tiam1沉默可以显著抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力。3.Tiam1沉默介导PI3K/Akt/mTOR信号通路调控EMT进程从而抑制胰腺癌细胞的转移与侵袭。