由黑粉菌(Sporisorium scitαineum)引起的甘蔗黑穗病是甘蔗生产上最主要的真菌病害之一,在世界各植蔗区内广泛流行,严重影响甘蔗产量和蔗糖分。由于该病菌侵入后潜伏时间长、人工接种田间种植抗病性评价需要2个作物季,周期较长,导致抗性评价只能在育种后期不多的甘蔗无性系上进行,育成抗病品种的几率和效率低,建立高效、快速的抗病性评价体系对抗病育种具有重要的现实意义。本研究在前期研究的基础上,以一组(9个)具有不同抗病性水平的甘蔗品种为研究材料,通过在蔗茎的芽组织上进行人工针刺接种甘蔗黑穗病菌,在环境可控条件下培养,于不同时间点(0d、1 d、3 d和7 d)取样,分析该病原菌侵入后在宿主中的带菌量情况以及宿主甘蔗对其侵染的生化和过氧化物酶类基因表达的响应,评价供试甘蔗基因型的抗病性,尝试建立甘蔗黑穗病抗性评价新技术,同时,分离甘蔗响应病原侵染的过氧化物酶类基因,并进行初步的功能鉴定,为后续开发基于基因表达分析的功能性标记奠定基础。主要研究结果如下:1.选取9个表型抗性水平不同的甘蔗品种,采用TaqMan实时荧光定量PCR技术,检测了接种黑穗病菌后不同时间点(0 d~7 d)蔗芽中的黑穗病菌拷贝数情况。结果显示随着接种时间的延长,该病原菌在甘蔗芽体中的带菌量呈上升趋势且在接种后7 d时达到峰值(介于2.49 ×105~6.09×106 copies/μL之间),各品种的不同时间点间拷贝数存在显著性差异,表明利用该技术对侵染早期的蔗芽组织进行病原菌拷贝数检测以判断其抗病性具有一定的可行性。所测试9个甘蔗基因型受黑穗病菌胁迫7 d后的病原菌拷贝数由低到高顺序为:YZ03-258<FN40<YZ01-1413<GT02-467<ROC22<YT96-86<YZ03-103<FN39<LC05-136,其中除 LC05-136、YT96-86 和 FN40 外,其余 6 个甘蔗基因型的黑穗病菌拷贝数高低顺序与田间黑穗病发病率大小排序结果(YZ03-258<YZ01-1413<LC05-136<YT96-86<GT02-467<ROC22<FN39<YZ03-103<FN40)基本相符,具体表现为田间表型抗黑穗病性越高则其受黑穗病菌侵染后的病原菌量相对较低。同时,本研究测定了接种黑穗病菌后4个时间点9个甘蔗无性系蔗芽组织中抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)、过氧化氛酶(catalase,CAT)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和 β-1,3-葡聚糖酶(β-l,3-glucanase)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)物质含量,分别从其相关性、主成分进行分析,结果显示病原菌侵染后,不同甘蔗基因型的生理生化参数值变化各异。其中,POD和β-1,3-glucanase之间、APX和β-1,3-glucanase之间呈显著正相关(P≤0.05),而其它指标间相关性不显著。主成分分析结果显示,可以用3个主成分(第1主成分包括POD、APX、CAT和SOD,第2主成分为β-1,3-glucanase,第3主成分为MDA,累积贡献率达80.177%)来反映甘蔗各生理指标的相对重要性,以上6个生理生化指标可作为黑穗病抗性评价的主要生理生化指标。以获得的上述生理生化指标的参数值为分析数据,采用隶属函数法对各基因型的抗病性进行综合评价,结果表明9个甘蔗基因型抗黑穗病性强弱顺序为:YZ03-258>FN40>YZ01-1413>GT02-467>ROC22>YZ03-103>YT96-86>FN39>LC05-136,这一排序结果与基于病原菌拷贝数变化的评价结果基本相符。说明基于接种后,甘蔗黑穗病菌拷贝数变化与侵染早期蔗芽生理生化变化及其综合分析,可在环境可控条件下,实现对甘蔗黑穗病抗性的快速鉴定。2.APX是清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)的重要酶类。本研究对黑穗病菌侵染后2 d的甘蔗抗(崖城05-179)、感(柳城03-182)黑穗病基因型品种进行APX酶活性测定,结果显示,抗病品种的APX酶活性显著高于感病品种。借助电子克隆及RT-PCR技术,从甘蔗中克隆获得一个APX cDNA序列ScAPX(GenBank登录号为KJ7565501),全长1 171bp,编码345个氨酸。ScAPX推导的编码蛋白不含信号肽,推测其为非分泌蛋白,定位于线粒体基质和叶绿体基质中的概率分别为91.1%和88.7%,与高粱(GenBank登录号为XP002447862.1)APX蛋白的氨基酸序列同源性高达97%以上。ScAPX为组成型表达基因,在甘蔗根、芽、叶、蔗皮和蔗髓中均有表达,但表达量在蔗皮中最高,叶中最低,前者是后者的19.7倍。ScAPX受水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)和过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)胁迫后的表达峰值出现时间较脱落酸(abscisic acid,ABA)、氯化钠(sodium chloride,NaCl)和聚乙二醇 8000(polyethylene glycol 8000,PEG 8000)处理早,且前者的ScAPX的表达量在胁迫初期累积增加,达到峰值后逐渐下降,而ABA、NaCI和PEG 8000处理后ScAPX表达量达到峰值后未见下降。尽管ScAPX表达量在上述外源胁迫下的变化特点存在差异,但该基因的表达均呈现出积极响应sA、MeJA、H202、ABA、NaCl和PEG 8000对甘蔗的胁迫。3.植物III类过氧化物酶存在于植物不同器官以及不同发育阶段,在植物生长发育中起重要作用。本研究从黑穗病菌侵染2 d的抗黑穗病性品种崖城05-179中分离出2条过氧化物酶基因ScPOD01和 ScPOD02 的 cDNA(GenBank 登录号分别为 KU298453 和 KU593507)及其 DNA(GenBank 登录号分别为KU311043和KU593508)序列。序列比对发现,ScPOD0I基因DNA序列具有典型的4-外显子和3-内含子结构,而ScPOD02的DNA则仅包含一个内含子。同源序列进化树分析表明,ScPOD0l与ScPOD02分别隶属于过氧化物酶III和过氧化物酶I家族成员。运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对外源胁迫下ScPOD01和ScPOD02基因的表达模式进行分析,结果显示两者的应答模式表现不同,除SA外,cPOD01正响应MeJA、ABA、H2O2、NaCI和PEG 8000对甘蔗的胁迫,而ScPODO2对各外源胁迫响应存在较大差别,其不仅正响应于SA、ABA、PEG 8000和NaCl,且响应的时间点不同,这可能与基因的功能有关。原核表达结果显示,和ScPOD0l和ScPOD02基因均能正常表达,诱导蛋白大小分别约为55kDa和60kDa。此外,瞬时表达结果显示,ScPOD01基因侵染后本氏烟叶片DAB染色相比对照略有加深,过表达ScPOD01后本氏烟免疫相关标记基因中HR相关基因NtHSR201和NtHSR203、JA相关基因NtPR-la/c均出现明显上调,而ET合成依赖基因NtEFE26则相反,这可以进一步证明该基因为SA不敏感型POD基因家族。SpPOD02基因侵染本氏烟叶片48 h的DAB染色加深,过表达ScPOD02后,目标基因ScPOD02的表达水平以及HR标记基因(NtHSR201和NtHSR203)、ET合成依赖基因(NtEFE26和NtAcccdeaminase)等本氏烟免疫相关基因均上调表达。对ScPOD01基因亚细胞定位情况进行分析,结果表明该基因定位于细胞膜/壁上,属于膜/壁型过氧化物酶,可能与细胞防御功能有关。4.利用RT-qPCR技术对课题组前期克隆到的2个甘蔗β-l,3-葡聚糖酶基因ScGluAl和ScG48(GenBank 登录号分别为 KC848050 和 KF664181)、2 个 CAT 基因ScCAT1 和ScCAT2(GenBank 登录号分别为KF664183和KF528830)以及本研究所分离的1个APX基因ScAPX和2个POD基因ScPOD01和ScPOD02,共四类7个基因,在9个不同抗病性水平的甘蔗品种中的表达情况进行分析。结果显示,在9个甘蔗基因型中,ScCAT1、ScCAT2、ScPOD01、ScPOD02和ScAPX等基因随着时间的变化,其表达趋势存在较大差异,应答趋势不明显。而ScGluAl基因应答黑穗病菌胁迫明显,其在抗病品种YZ03-258和LC05-136及中感病品种FN39中表达量较高,在感病品种中表达量较低,同时,该基因在不同甘蔗基因型中的表达基本均呈上升趋势,且各时间点转录本均高于对照,而ScG48在抗病品种中应答时间较早,而在中感和感病品种中应答时间具有滞后性,以上结果表明ScGluAl和ScG48有望作为开发甘蔗抗黑穗病功能性标记基因的候选基因,有待进一步深入评价。