当前养猪业最大的威胁就是疾病,特别是一些常见的人畜共患病,还会严重影响人类的健康。流行性乙型脑炎就是其中之一。流行性乙型脑炎(简称乙脑),别称日本脑炎,病原体为流行性乙型脑炎病毒,简称乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)。乙脑病毒是一种虫媒病毒,属黄病毒科黄病毒属,能引起高热、头痛、呕吐等症状,严重者全身发烧、脑水肿、抽痉不止、呼吸困难,循环衰竭而导致死亡,并且伴有后遗症。乙脑属于人畜共患病,不仅可引起人中枢神经系统等急性疾病,致死率较高,而且在动物中主要通过三带喙库蚊进行传播,有鸟-蚊-鸟、蚊-蝙蝠-蚊、猪-蚊-猪和猪-蚊-人等传播方式。乙脑病毒会感染猪群,造成种猪繁殖障碍,最终导致养猪业的巨大经济损失,并且病毒血症时间较长。猪血液中病毒载量较高,有强传染性,是人类感染乙脑的主要传染源。乙脑是我国夏季和秋季主要流行性传染病之一,除了在青海、西藏、新疆,全国各地均为易感地区,每年我国感染人数可达2.5万人,致死率可达10%,且15%的患者留有不同程度的后遗症。本研究意在初步探索乙脑病毒感染PK15细胞后的增殖情况,筛选与病毒感染相关的lnc RNA,对lnc RNA进行亚细胞定位及靶基因分析。本研究通过免疫荧光实验检测病毒感染细胞后结构蛋白E的表达情况,采用TCID50法检测细胞中病毒的增殖情况,利用实时荧光定量PCR检测病毒感染细胞后lnc RNA的表达水平,在NONCODE数据库对lnc RNA进行亚细胞定位,通过star Base、NONCODE、KEGG等数据库对期进行靶基因预测及相关信号通路分析。本研究为探索宿主细胞lnc RNA对病毒增殖的影响奠定了一定的基础。1.JEV感染PK15细胞差异表达的lncRNA研究研究前期对PK15细胞进行攻毒,通过免疫荧光实验检测病毒感染细胞后不同时间段病毒结构蛋白E的表达情况。结果表明,在病毒感染细胞36小时后,病毒结构蛋白E的表达显著上升。TCID50实验也证实在病毒感染PK15细胞36小时后,病毒滴度呈显著上升。病毒感染细胞后,将样本送至北京博奥生物有限公司进行转录组测序。结果表明,JEV处理组与Mock对照组相比,有452条lnc RNA的表达是上升的,404条lnc RNA的表达是下降的;有2253条m RNA的表达是上升的,1912条m RNA的表达是下降的。基因差异热图表明样本的重复性较好。本研究初步探索的lnc RNA可能在乙脑病毒复制和增殖过程中发挥重要作用。2.天然免疫相关的lncRNA NONSUST006715.1调控乙脑病毒增殖及信号通路研究本研究主要聚焦于天然免疫相关的lnc RNA NONSUST006715.1(lnc RNA B)对乙脑病毒增殖的影响。乙脑病毒感染PK15细胞后,设计lnc RNA的反义核酸,以降低lnc RNA的表达。结果表明,敲低lnc RNA B的表达,乙脑病毒的表达显著上升,说明lnc RNA具有抑制乙脑病毒增殖的功能。本研究通过几种常见的信号通路,分别用抑制剂处理PK15细胞,定量检测lnc RNA B的表达;蛋白免疫印迹检测抑制剂处理后乙脑病毒NS3蛋白的表达。结果表明,大部分抑制剂处理PK15细胞后,lnc RNA B的表达呈下降趋势;而ZK811752(CCR1抑制剂)处理PK15细胞后,lnc RNA B的表达呈上升趋势。ZK811752抑制剂处理PK15细胞后。乙脑病毒NS3蛋白的表达呈显著下降的趋势。以上研究表明,CCR1作为宿主免疫相关的趋化因子信号通路中关键蛋白,其存在会抑制lnc RNA B的表达,从而促进病毒的增殖。研究后期,通过荧光定量PCR检测敲减CCR1对lnc RNA B的影响。结果表明,抑制CCR1会增强lnc RNA B的表达,而lnc RNA B会抑制乙脑病毒的增殖。此外,荧光定量PCR检测敲减CCR1对lnc RNA B转录因子表达是否有一定的影响。结果表明,敲减CCR1,增强了lnc RNA B启动子区转录因子SP1的表达。为探索蛋白与基因的相互作用,研究通过CHIP实验检测敲减CCR1对转录因子SP1在lnc RNA B启动子区的影响。结果表明,敲减CCR1确实会影响SP1在lnc RNA B启动子区的结合。本研究证实lnc RNA B具有抑制乙脑病毒增殖的功能,且病毒通过激活趋化因子信号通路中的CCR1蛋白,抑制转录因子SP1结合到lnc RNA B启动子区,从而下调lnc RNA B的表达,最终进一步促进病毒的增殖。