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昆虫化学感受蛋白(CSPs)在昆虫与外界的物质、能量、信息交流的过程中起到十分重要的作用。国际上，对昆虫CSPs的结构与功能作了较多的研究，证实CSPs参与昆虫的取食、发育、免疫以及节律调节等重要的生命活动。本文以重要的水果害虫、检疫性害虫——桔小实蝇为试虫，克隆了桔小实蝇化学感受蛋白基因Bdor CSP；研究了Bdor CSP基因的时间、空间及性别表达特征；对Bdor CSP进行了原核表达、分离纯化；应用Discovery Studio2.0软件模拟了BdorCSP与闹羊花素—Ⅲ的结合，确定了蛋白的关键氨基酸；应用荧光猝灭法证实了BdorCSP与闹羊花素—Ⅲ的结合；应用T7噬菌体展示技术进行了BdorCSP互作蛋白的筛选，为进一步研究昆虫的CSPs信号传导途径奠定了基础。主要结果如下：
⑴根据GenBank中登录的昆虫化学感受蛋白基因序列，设计简并引物，采用RACE技术，以桔小实蝇触角cDNA为模板，克隆了BdorCSP基因的全长序列，GenBank登录号为EU564815。分析表明BdorCSP cDNA全长为778 bp，ORF区域包括157个氨基酸，其中N端前22个氨基酸为信号肽，成熟肽包含135个氨基酸。同源性分析表明，BdorCSP与黑腹果蝇的化学感受蛋白(AAA21358)相似性最高，序列相似性为51％；与萝卜蚜的化学感受蛋白(ABU56011)相似性最低，序列相似性为31.0％。
⑵采用RT-PCR半定量的方法对BdorCSP在桔小实蝇不同性别、不同部位中的表达特征进行分析。结果表明，BdorCSP在雌雄虫触角中的表达量最高，其次为去除触角的头部。BdorCSP在雌雄虫中足的表达量最低。雌虫前足中的表达量明显高于雄虫前足中的表达量，而雌虫生殖节中的表达量明显低于雄虫生殖节中的表达量。BdorCSP在各个发育阶段都有表达，在整个发育期，化蛹第1天的BdorCSP表达量最低，从化蛹到羽化期间，表达量逐渐升高，10天蛹期表达量达到最高。刚羽化雌虫的表达量明显高于雄虫的表达量。BdorCSP的这种时空分布广泛性，预示其可能参与细胞的多种信号传导途径。
⑶构建了BdorCSP基因原核表达载体pET—28a(+)—BdorCSP，并采用IPTG诱导的方法在大肠杆菌BL21(DE3)中表达N端带有6×His的融合蛋白，分子量大小约为16KDa，融合蛋白以可溶态及包涵体形式存在。用Western blot分析表明，表达的融合蛋白即为重组目的蛋白。
⑷用Ni—His亲和纯化的方法对可溶态融合蛋白进行纯化，用凝血酶酶切纯化的重组蛋白，产物经过His亲和柱的纯化除去标签。进一步采用SDS-PAGE电泳及Western blot的方法验证，结果表明融合蛋白的His标签已经切除完全。
⑸利用Discovery Studio软件，同源模建了BdorCSP的初始三维结构模型，对模型进行动力学优化后得到BdorCSP最优构象。利用CDOCKER对接程序进行了闹羊花素—Ⅲ与BdorCSP的模拟结合研究，MM-PBSA程序计算得到闹羊花素—Ⅲ与BdorCSP蛋白的结合能为—27.08 kcal/mol。对活性位点中的单个氨基酸残基与闹羊花素—Ⅲ的相互作用能进行计算，结果表明LEU23，TYR26，ILE27，GLU31，ASP39，SER40，LEU43，LYS44，LEU73，TRP81，LEU84在BdorCSP与闹羊花素—Ⅲ的结合中起到关键作用。而TYR26，ILE27分别与闹羊花素—Ⅲ形成氢键，在复合物的形成中贡献较大。
⑹应用色氨酸荧光猝灭法研究了BdorCSP与闹羊花素—Ⅲ的结合特性。成熟肽BdorCSP有1个色氨酸残基(TRP81)，色氨酸残基使蛋白具有内源荧光。结果表明，闹羊花素—Ⅲ对BdorCSP的荧光强度具有荧光猝灭效应，而且随着化合物浓度的增加，猝灭效应增强。表明BdorCSP与闹羊花素—Ⅲ相结合，且色氨酸残基(TRP81)位于结合位点，参与了复合物的形成，从而引起BdorCSP内源荧光的猝灭。由荧光猝灭常数可知闹羊花素—Ⅲ对BdorCSP的荧光猝灭属于静态猝灭。光谱实验结果与上述分子模拟预测结果相一致。
⑺构建了桔小实蝇触角cDNA的T7噬菌体展示文库，初始文库的滴度为1.03×106 pfu/mL，符合cDNA初始文库的要求；对初始文库进行放大，放大后文库的滴度为1.69×109 pfu/mL。以纯化并去除His标签的BdorCSP为诱饵蛋白，对噬菌体展示文库进行4轮淘筛。随机挑取了32个噬菌斑单克隆，以T7 Select UP Primers及T7 Select DOWN Primers为引物进行PCR验证，进一步用T7抗体对32个克隆进行ELISA检测，结果表明有27个克隆为阳性克隆。对ELISA阳性克隆进行测序。通过BLAST序列比对，27个阳性克隆分别为，二硫化异构酶、丝氨酸蛋白酶、Take Out蛋白、细胞色素氧化酶亚基Ⅲ、气味结合蛋白、bzip转录因子、脱氢酶亚基Ⅰ和核糖体蛋白等。其它的克隆序列在GenBank中未查到相似基因，可能是一些尚未公布的新基因片段。这些克隆的获得，为进一步研究BdorCSP在信号传导中的作用奠定了基础。