【摘 要】
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目的:既往的研究已报道葡萄糖是细胞内ATP合成的原料,葡萄糖饥饿能够激活能量感受器AMPK。AMPK全酶由α、β和γ三个亚基组成,最近的研究还发现激活的AMPK定位于溶酶体膜上。基于线粒体在产能和代谢上的重要作用,激活的AMPK是否也能部分定位于线粒体膜上?肿瘤细胞在葡萄糖饥饿下,细胞核与线粒体之间是否有信息传递和交流?这期间有哪些蛋白的变化会反映在转录水平和线粒体上?这些问题均不清楚,本研究旨在
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目的:既往的研究已报道葡萄糖是细胞内ATP合成的原料,葡萄糖饥饿能够激活能量感受器AMPK。AMPK全酶由α、β和γ三个亚基组成,最近的研究还发现激活的AMPK定位于溶酶体膜上。基于线粒体在产能和代谢上的重要作用,激活的AMPK是否也能部分定位于线粒体膜上?肿瘤细胞在葡萄糖饥饿下,细胞核与线粒体之间是否有信息传递和交流?这期间有哪些蛋白的变化会反映在转录水平和线粒体上?这些问题均不清楚,本研究旨在探索葡萄糖饥饿下细胞转录组的变化和线粒体上蛋白的变化,以期找到肿瘤细胞中一些新的葡萄糖饥饿响应因子。方法:1.将He La细胞正常培养或者进行葡萄糖饥饿处理,提取总RNA,再进行转录组(RNA-seq)测序。把得到的数据进行数据库比对和软件分析,以挖掘有显著表达差异的基因。2.使用慢病毒感染He La细胞,构建过表达线粒体标签蛋白3×HA-OMP25的稳转细胞株。然后将此细胞株进行线粒体免疫共沉淀以获取纯的线粒体,建立新的纯化线粒体方法,我们称之为线粒体免疫共沉淀(mitochondrial-precipitation,mito-IP)。3.用葡萄糖饥饿处理上述肿瘤细胞,然后分离纯化线粒体,通过免疫印迹法验证葡萄糖饥饿前后的线粒体蛋白变化以及AMPK能否定位于线粒体上。结果:1.通过对RNA-seq的结果分析,He La细胞在葡萄糖饥饿后有107个基因显著上调表达,48个基因显著下调表达。2.通过GO富集分析,本课题发现2个重要的子群(Subcluster)。其中一个子群的基因在葡萄糖饥饿后显著上调,而且主要富集于核小体、内质网应激反应和自噬泡形成的生物过程中;另一个子群的基因在葡萄糖饥饿后显著下调,而且主要富集于线粒体和其他膜细胞器之中。3.通过KEGG富集分析,发现葡萄糖饥饿后差异表达的基因主要富集于酒精性中毒、系统性红斑狼疮、内质网的蛋白加工、癌症和AMPK的信号通路中。在酒精性中毒及系统性红斑狼疮的信号通路中,均是组蛋白H2B、H3、H4表达上调。在内质网的蛋白加工的信号通路中,CHOP、GADD34、BIP、HERP表达上调,激活内质网未折叠蛋白反应。在癌症信号通路中,p21、c-Jun、c-Fos、GPCR表达上调,而周期蛋白Cyclin D1表达下调。在AMPK的信号通路中,ULK1和PGC-1α上调。但在糖代谢、三羧酸循环、氧化磷酸化的信号通路中,并无发现显著表达差异基因的分布。4.慢病毒感染后的He La细胞进行免疫印迹实验,结果显示HA的特异性条带,证明成功构建过表达线粒体标签蛋白的肿瘤细胞株。利用免疫共沉淀技术分离纯化线粒体,以及使用免疫印迹法验证所获得线粒体的蛋白纯度,其结果只显示内质网和线粒体标志物蛋白的条带,但高尔基体、细胞核、溶酶体、过氧化物酶体标志物的蛋白条带显示不出。5.通过正常处理和葡萄糖饥饿处理He La细胞,纯化其线粒体,使用免疫印迹法验证饥饿前后AMPK各亚基在线粒体上的变化。结果显示葡萄糖饥饿后的磷酸化AMPKα蛋白条带明显比正常培养组的灰度值高,AMPKα和AMPKβ各个亚基的蛋白条带均会出现在葡萄糖饥饿组和正常培养组的线粒体上,而AMPKγ各个亚基的蛋白则均不出现条带。结论:1.在葡萄糖饥饿下,肿瘤细胞累积大量未折叠蛋白,激活内质网及线粒体的未折叠蛋白反应,并且细胞核和线粒体基因均发生显著性改变,这些基因参与调控细胞的生长、凋亡、线粒体自噬和新生等生物过程。2.葡萄糖饥饿前后均有AMPK定位于线粒体上,但仅有AMPKα和AMPKβ两个亚基,而无AMPKγ亚基,说明AMPK在线粒体上的定位与葡萄糖无关;AMPK除了可以定位于溶酶体,亦可部分定位于线粒体。
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