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本论文的研究目的是筛选油菜花粉提取物中具有抑制前列腺癌细胞株Du-145、PC-03增殖的有效组分,探明其抗前列腺癌的机理。 本实验采用MTT法筛选得到油菜花粉提取物中具有体外抑制前列腺癌细胞Du-145、PC-03增殖的有效成分PW9。通过显微观察细胞形态变化,DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,流式细胞仪对DNA含量分析及细胞周期核相检测,研究了PW9对Du-145、PC-03细胞的凋亡诱导作用。进而使用RT-PCR检测不同浓度PW9作用后,Du-145、PC-03细胞中凋亡相关基因:Bcl-2、Bcl-XL、Bid、Bax的表达差异,用Western blot法检测了细胞中凋亡相关蛋白:Fas、 Hsp70、Caspase-3,7,8,9的表达变化,研究了PW9诱导前列腺癌细胞凋亡的信号传导途径。同时还使用TRAP-PCR方法检测了前列腺癌细胞端粒酶活性的变化。 本论文所获主要研究结果如下:MTT显示PW9对Du-145、PC-03细胞的增殖存在抑制作用,其IC50分别为:0.632±0.096 mg/ml和0.412±0.055mg/ml。在PW9作用48h后,两种前列腺癌细胞均呈现一系列凋亡的形态学变化;胞质空泡化,核固缩并边缘化;细胞体积缩小、胞质固缩,但细胞膜仍然保持完整。DNA电泳显示400、800μg/ml药物作用48h后,呈现清晰的DNA梯状条带。流式细胞仪检测显示在药物处理后,Du-145、PC-03的G1期细胞随药物浓度增高而增多,并出现明显的凋亡峰,峰面积随药物浓度增高而增大。 RT-PCR显示,经PW9作用12h后,Du-145细胞的Bcl-2、Bcl-XL、Bid、Bax基因表达均无明显变化,而PC-03细胞的Bcl-2基因表达无明显变化,但Bid、Bax基因表达明显上调,Bcl-XL基因表达显著下调。Western blot显示:经PW9处理48小时后,Du-145细胞中Fas、 Caspase-8、Caspase-3蛋白表达量明显增加,Hsp70、Caspase-7、Caspase-9的表达无明显变化。PC-03细胞中Fas、Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9的表达显著上升,Hsp70表达下降,Caspase-7表达无明显变化。 TRAP-PCR-银染和TRAP-PCR-ELISA显示,PW9对DU-145、PC-03细胞端粒酶活性有一定的抑制作用,并随药物浓度增高而增强。 以上研究结果证明,油菜花粉提取物PW9对前列腺癌细胞株Du-145、PC-03具有生长抑制作用,能使前列腺癌细胞停滞在细胞周期的G1期,并诱导Du-145、PC-03细胞发生凋亡。 PW9诱导Du-145细胞凋亡的信号通路可能是PW9刺激Du-145细胞上调Fas基因的表达,大量Fas产生的刺激促使死亡诱导信号复合体形成,引起Caspase-8的活化,随后Caspase-3裂解,最终导致细胞的凋亡。PW9诱导的PC-03细胞凋亡信号通路可能有两条:一条与上相同,另一条可能是诱导Fas激活Caspase-8,使Bid裂解为去顶Bid(tBid),tBid与Bak二聚化,引起细胞色素C的释放,进而激活Caspase-9,引起下游效应单位Caspase-3裂解,导致细胞凋亡。 此外,PW9还可以通过降低Du-145、PC-03前列腺癌细胞中端粒酶活性阻止细胞的恶性增殖。