研究目的钙化性主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease,CAVD)是目前老年人最常见的瓣膜疾病。然而,CAVD的发生机制仍不十分明确,药物治疗效果极差。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin kexin type 9,PCSK9)是枯草溶菌素蛋白激酶K亚家族的一个成员,与血脂代谢、炎症、细胞凋亡等有关。近期的研究表明PCSK9与动脉粥样硬化性疾病的发生、发展以及预后有关,CAVD的发病机制与动脉粥样硬化性疾病存在诸多相似之处,而PCSK9是否与CAVD的发病及疾病进展有关尚不得而知。本研究通过在体和离体两个层面对PCSK9水平、血脂包括总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、脂蛋白(a)以及炎症因子与CAVD发生的关系进行了探讨。第一部分拟探讨血浆PCSK9水平与不同程度钙化性主动脉瓣疾病之间的关系。第二部分拟探讨CAVD患者主动脉瓣局部PCSK9水平与巨噬细胞、炎症因子表达水平之间的关系。研究方法1)通过经胸心脏彩超和心脏双源CT检查筛选2015年3月至2015年12月天津市胸科医院CAVD患者112例及阴性对照组患者40例。将患者通过CT定量评分系统对主动脉瓣钙化(AVC)进行分组:AVC 1、2、3和4级,并通过软件计算主动脉瓣钙化积分。通过生化分析仪检测总胆固醇(TC),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),甘油三酯(TG),载脂蛋白A1(Apo A1)及载脂蛋白B(Apo B),脂蛋白(a){LP(a)},血糖(BS)和高敏C反应蛋白(hs CRP)水平,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血浆PCSK9水平。分析不同组别血浆PCSK9水平、血脂谱、hs CRP的差异以及与主动脉瓣钙化积分之间的关系。2)通过经胸心脏彩超和双源CT超筛选2015年3月至2015年12月在天津市胸科医院心外科切除的主动脉三叶瓣标本75例,钙化组59例和对照组16例。采集相关病史及生化指标。记录心脏彩超及CT测得的钙化积分。对主动脉瓣进行钙化染色。免疫荧光染色测定主动脉瓣瓣膜组织PCSK9和单核/巨噬细胞标记(MOMA2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应测定PCSK9、平滑肌肌动蛋白α2(ATCA2)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-6和α-SMA的m RNA表达水平,并进行相关性分析。研究结果1)本研究第一部分即在体研究共入选152例患者。根据超声心动图结果将患者分为钙化组112例和非钙化组(对照组)40例;再根据双源CT结果将所有患者分为AVC 1级40例、AVC 2级32例、AVC 3级48例和AVC 4级32例。与对照组(AVC 1级)比较,AVC 2-4级患者在男性比例、吸烟、高血压、糖尿病方面组间差异无统计学意义,四组患者的血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素受体拮抗剂(ACEI/ARB)、β受体阻滞剂、钙拮抗剂、利尿剂和阿司匹林等药物的使用差别均无统计学意义。四组患者左室射血分数和左室舒张末期内径差异亦无统计学意义,四组患者主动脉瓣钙化积分分别为0,42.6–63.4,140.6–182.2和324.7–572.0,差异有统计学意义(p<0.001)。AVC 2-4级患者TC,LDL-C,Apo B和LP(a)水平明显高于AVC1级(对照组)(p均<0.05)。四组患者的TG,HDL-C,Apo A1,hs CRP和BS组间比较差异无统计学意义(p>0.05)。AVC 2-4级组血浆PCSK9水平高于对照组即AVC 1级患者(p<0.01)。主动脉瓣钙化积分与TG(r=0.296),LDL-C(r=0.395),Apo B(r=0.263),LP(a)(r=0.408)和PCSK9(r=0.214)均存在明显相关性,主动脉瓣钙化积分与hs CRP之间无相关性。将CAVD患者单独分析,主动脉瓣钙化积分与LDL-C(r=0.257)和LP(a)(r=0.286)均存在明显相关性,而主动脉瓣钙化积分与血浆PCSK9和hs CRP不存在相关性。CAVD患者PCSK9水平明显高于对照组,PCSK9与CAVD的发生存在相关性,而与主动脉瓣钙化积分之间无相关性。对钙化性主动脉瓣疾病的危险因子包括年龄、男性、糖尿病、高血压、吸烟、TG、LDL-C、LP(a)和PCSK9进行二元logistic回归分析表明,仅年龄(p=0.017),LP(a)(p=0.005)和PCSK9(p=0.006)是CAVD的独立危险因素。2)第二部分即离体研究中两组患者在年龄、性别、体质量指数、吸烟者比例、脑血管疾病史、冠心病疾病史、高血压、糖尿病、血脂异常等指标方面比较差别无统计学意义。CAVD组主动脉瓣面积明显低于对照组(p<0.001),跨主动脉瓣峰流速和主动脉瓣平均跨瓣压力阶差则明显高于对照组(p<0.001)。CAVD组患者的左心室舒张末期内径明显高于对照组,左心室射血分数低于对照组(p均<0.05)。AVC评分在CAVD组患者明显增高(p<0.001)。与正常瓣膜相比,钙化组标本的厚度明显增加,经Von Kossa染色,所有钙化组标本均可见棕黑色钙盐沉积,对照组标本无钙盐沉积。免疫荧光染色方法检测到PCSK9在人主动脉瓣中的表达,钙化组瓣膜PCSK9含量明显高于对照组。钙化组MOMA-2和α-SMA的含量均高于对照组(p均<0.01)。对PCSK9、MOMA2和α-SMA进行相关性分析,PCSK9与MOMA2和α-SMA均呈正相关(r=0.342,p<0.01;r=0.277,p<0.01)。与对照组比较,钙化组瓣膜组织PCSK9和ACTA2的m RNA相对表达水平呈现显著的上调趋势(3.03:1和4.00:1)(p<0.01),TNF-α的m RNA也表现为明显上调趋势(4.75:1)(p<0.05),两组IL-6的m RNA相对表达水平无统计学意义。钙化组瓣膜组织LDLR m RNA呈现明显的下调趋势(1:1.58)(p<0.05)。结论1)血浆LDL胆固醇在CAVD患者中明显增高,而且LDL胆固醇与主动脉钙化积分之间存在相关性。脂蛋白(a)是CAVD发病的独立危险因素之一。2)CAVD患者PCSK9水平明显高于对照组,PCSK9与CAVD的发生存在相关性,而与主动脉瓣钙化积分之间无相关性。3)随着钙化程度增高,血浆PCSK9水平有下降趋势。PCSK9与主动脉瓣钙化严重程度无关。PCSK9可能通过对血脂尤其脂蛋白(a)的影响参与了CAVD的发生过程。4)主动脉瓣组织局部亦有PCSK9表达,发生钙化的瓣膜组织在病变周围PCSK9表达较正常瓣膜增加。5)钙化瓣膜的巨噬细胞的标记物MOMA2和平滑肌细胞标记物ACTA表达水平上调,LDL受体表达下调,巨噬细胞的标记物MOMA2和TNF-α在钙化组瓣膜组织m RNA表达上调。PCSK9可能通过非低密度脂蛋白胆固醇的方式而直接促进炎症反应过程。