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1.研究背景疟疾仍然是一种严重危害全球健康的重大传染病。疟原虫感染可导致严重的临床表现,其中疟疾相关性急性肺损伤(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是有较高发病率和极高死亡率的重症疟疾。近年来,人们开始更多地关注疟疾患者的肺部病变如ALI和ARDS。ALI的病理生理变化往往出现在脑型疟疾症状之前,表现为炎症介导的内皮损伤和毛细血管通透性增加导致的弥漫性肺泡破坏,并且这种损伤可持续到用药物治疗清除寄生虫之后[1]。然而,到目前有关疟疾相关ALI/ARDS的免疫病理机制却鲜有报道。galectin蛋白家族是在先天和适应性免疫应答中起重要作用的一种高度保守的聚糖结合蛋白家族,其中galectin-1、3、8和9在肺组织病理生理过程中发挥着重要作用[2-5],其中galectin-9/Tim-3通路在病毒、细菌及寄生虫感染过程中均发挥着重要的作用。galectin-9与其天然受体Tim-3结合可特异性地抑制Th1和Th17细胞的免疫反应[6]。此外,galectin-9还可与其他受体(CD44、CD137和PDI)结合发挥相应功能[7-9]。然而,galectin-9及其受体在疟疾相关ALI中扮演的角色目前尚不清楚。2.研究目的和意义本研究旨在探讨乳糖封闭galectin蛋白家族后对伯氏疟原虫感染急性肺损伤的作用机制。我们的结果表明galectin-9及其受体在疟疾相关ALI的发生发展过程中发挥着重要作用。3.第一部分1)材料和方法(1)建立小鼠模型雌性昆明小鼠腹腔内注射106个Plasmodium berghei ANKA(Pb ANKA)感染的红细胞,以建立疟疾相关ALI小鼠模型。每日监测死亡率。(2)血虫率检测对Pb ANKA感染小鼠作尾血涂片,姬姆萨染色,每天镜检监测血虫率。(3)组织病理检测CO2吸入法处死小鼠,取小鼠的肺和纵膈淋巴结(mediastinal lymph nodes,MLNs)进行HE(hematoxylin and eosin)染色,并评估组织学变化。(4)免疫组化染色使用SABC法对肺组织和MLNs进行galectin-9和Tim-3免疫组化染色。阳性细胞呈暗褐色。(5)细胞因子检测使用q RT-PCR技术检测小鼠肺和MLNs中galectin-9、Tim-3、TNF-α、IL-6、IL-10的m RNA表达水平。2)结果(1)疟疾相关ALI小鼠模型的建立Pb ANKA感染小鼠在感染后8-22天死亡:其中32%的小鼠在感染后8-10天死亡并表现出重症疟疾症状与神经系统体征;其余小鼠在感染后18-22天死亡并表现为高血虫率和呼吸窘迫。感染小鼠死亡前的BALF总蛋白含量显著升高,提示肺泡-毛细血管膜屏障的破坏并出现ALI。(2)肺和MLN组织病理变化疟原虫感染小鼠的肺组织呈现中度至重度的炎症细胞浸润、肺泡水肿、出血和肺泡隔的增厚。感染小鼠的MLNs表现为正常结构(皮质和髓质区)的破坏。(3)疟原虫感染小鼠肺和MLN组织galectin-9和Tim-3免疫组织化学染色小鼠在感染后5、10、15和20天肺部和MLN组织中galectin-9和Tim-3染色阳性细胞显著增加。(4)疟原虫感染小鼠肺和MLN组织galectin-9和Tim-3 m RNA表达感染小鼠肺组织galectin-9 m RNA的表达在感染后5、10、15和20天显著上调,MLNs中galectin-9 m RNA的表达在感染后15和20天显著上调。感染小鼠肺和MLNs中Tim-3 m RNA的表达均在感染后10、15和20天显著上调。(5)肺和MLN组织中促炎和抗炎性细胞因子的表达与对照组相比,肺组织TNF-α表达水平在感染后15天显著增加,但MLN组织TNF-α表达水平在感染后5、10、20天显著降低。与对照组相比,肺组织IL-6m RNA表达在感染后10、15、20天显著增加,MLN组织IL-6 m RNA表达在感染后5和10天显著增加。与对照组相比,肺和MLN组织IL-10 m RNA表达在感染后10、15、20天显著增加。2)结论在用Pb ANKA感染昆明小鼠建立了疟疾相关ALI小鼠模型的基础上,我们发现感染小鼠肺和MLN组织中的Galectin-9和Tim-3阳性细胞数量较正常对照组显著增加;Galectin-9和Tim-3 m RNA在感染小鼠肺和MLN组织中高表达,结果提示Galectin-9/Tim-3通路在疟疾相关ALI模型中可能发挥着作用。4.第二部分1)材料和方法(1)建立小鼠模型雌性昆明小鼠腹腔内注射106个Plasmodium berghei ANKA(Pb ANKA)感染的红细胞,以建立疟疾相关ALI小鼠模型。一部分感染小鼠腹腔内注射300 m Mα-乳糖溶液100μl/次,从感染后第1天开始,每天两次。每日监测小鼠一般状况。(2)血虫率检测对Pb ANKA感染小鼠作尾血涂片,姬姆萨染色,每天镜下检测血虫率。(3)组织病理检测CO2吸入法处死小鼠,取小鼠的肺组织进行HE染色,并评估组织学变化。(4)免疫组化染色使用SABC法对各组小鼠肺组织进行CD68免疫组化染色。阳性细胞呈暗褐色。(5)细胞因子检测使用q RT-PCR技术检测小鼠肺和MLNs中galectin-1、3、8和9,galectin-9的受体Tim-3、CD44、CD137和PDI,Tim-3的另一配体HMGB1和CD44的另一配体透明质酸(hyaluronic acid,HA)的相关酶HAS1-3(Hyaluronan synthases),IL-4、IL-10、IFN-α、β和γ的m RNA表达水平。(6)免疫荧光染色对小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的细胞成分和小鼠肺组织进行CD68和galectin-9以及CD68和Tim-3免疫荧光双染。CD68阳性单核巨噬细胞显绿色荧光,galectin-9和Tim-3阳性细胞显红色荧光,双染阳性细胞呈现黄色。(7)细胞凋亡检测用TUNEL法检测肺石蜡切片的细胞凋亡变化。(8)腹腔巨噬细胞的分离和培养从KM小鼠腹腔分离巨噬细胞并与5×106个Pb ANKA感染的红细胞共培养24小时。为阻断自分泌galectin分子与其受体的结合,在加入Pb ANKA感染红细胞之前将细胞置于含30m Mα-乳糖的培养基中孵育1小时。样品储存在-80℃作进一步分析。2)结果(1)乳糖阻断增加疟原虫感染小鼠BALF总蛋白含量、血虫率和死亡率乳糖阻断感染组小鼠感染后7天死亡率为100%,显著高于单感染组小鼠。相比单感染组小鼠,阻断组小鼠BALF总蛋白含量在感染后5天和7天均显著更高;血虫率在第4、5和6天显著增高;肺组织虫荷在感染后5天显著增高。(2)乳糖阻断加重疟原虫感染小鼠病理损伤与单感染组小鼠相比,在感染后5天和7天乳糖阻断感染组小鼠肺部炎症显著加重,淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞等炎症细胞浸润增加。(3)感染小鼠肺和MLN组织中galectins、galectin-9的受体及其配体、IFN-I、IFN-II、IL-4和IL-10的表达肺组织中发挥作用的galectin蛋白分子包括galectin-1、3、8和9。我们的结果显示,在感染后5天和7天,单感染组小鼠和乳糖阻断感染组小鼠的肺组织中只有galectin-9显著表达,而MLN中galectin-3、8和9均有高表达。Galectin-9的受体Tim-3、CD44、CD137和PDI在本模型中皆高表达。用乳糖阻断galectin-9与其受体的结合后,Tim-3的另一配体HMGB1及CD44的另一配体HA的相关酶HAS1-3的表达在感染后第5天皆有代偿性升高。乳糖阻断后,小鼠肺组织IFN-α、β和γ表达水平在感染后第5天显著升高,然而IFN-α和β在第7天显著降低;MLN中IFN-α和β表达水平在第5天显著降低,IFN-α、β和γ在第7天显著降低。乳糖阻断后,IL-4表达水平在肺组织于感染后第5天显著升高,在MLNs于感染后7天显著降低,IL-10表达水平在肺组织于感染后5天和7天显著升高,在MLNs于感染后5天显著升高。(4)乳糖阻断促进感染小鼠肺部巨噬细胞浸润相比于单感染组小鼠,乳糖阻断感染组小鼠CD68+巨噬细胞的数量在感染后7天显著升高。(5)BALF和肺组织中的巨噬细胞高表达galectin-9和Tim-3与对照组(正常对照组和乳糖对照组)相比,单感染组和乳糖阻断感染组小鼠BALF中CD68+巨噬细胞表现出更强的galectin-9和Tim-3荧光信号;同样,肺组织中表达galectin-9和Tim-3的CD68+巨噬细胞数目更多。(6)乳糖阻断促进感染小鼠肺部的细胞凋亡乳糖阻断感染组小鼠在感染后5天和7天的肺部凋亡细胞数目均较单感染组小鼠显著增加。乳糖阻断感染组小鼠肺部凋亡细胞在感染后第7天比在第5天显著增多。(7)Galectin-9/Tim-3通路抑制Pb ANKA刺激后小鼠腹腔巨噬细胞IFN-I的表达Pb ANKA刺激后的小鼠腹腔巨噬细胞高表达galectin-9、Tim-3、HAS-3、IFN-I(IFN-α、β)、IFN-II(IFN-γ)和IL10。然而用乳糖阻断galectin-9与Tim-3的结合后,IFN-α、β的表达显著升高。3)结论1.用α-乳糖阻断伯氏疟原虫感染小鼠体内Galectin蛋白,特别是Galectin-9及其受体,发现小鼠的死亡率和血虫率均升高,肺组织炎症和病理损伤加重,肺组织巨噬细胞浸润增多,凋亡细胞数量增加。2.m RNA检测显示,小鼠肺和MLN组织HMGB1和HAS1-3的表达在乳糖阻断后显著升高,这可能与阻断后肺病理损伤加重有关。3.m RNA检测显示,小鼠肺组织IFN-I的表达在乳糖阻断后显著升高,进而导致感染小鼠血虫率的升高、病理损伤加重,并促进细胞凋亡。4.m RNA检测显示,小鼠肺和MLN组织IL-10的表达在乳糖阻断后显著升高,这可能与阻断后血虫率的升高和肺病理损伤加重有关。