研究背景和目的急性心肌梗死等缺血性心脏病是致死率最高的疾病之一,其发病机理是冠状动脉循环受阻导致供应到心脏的血液减少,心肌细胞由于营养缺乏而发生大量死亡,对心室造成不可逆的损伤。因此抑制缺血引起的心肌细胞凋亡,对于缺血性心脏疾病的治疗非常重要。自噬增加是缺血心肌的另一重要病理现象,通过清除细胞内损伤细胞器或长寿蛋白来维持细胞生存所需基本能量,因此,适度的自噬对于细胞的存活是有益的,但过度的自噬可能会引发细胞死亡。自噬和凋亡互相联系形成复杂的关系网络,影响自噬与凋亡的分子机制需要进一步研究。我们前期的研究发现鞘氨醇磷酸胆碱(Sphingosylphosphorylcholine,SPC)能通过自噬抑制缺血心肌细胞的凋亡。SPC是一种生物活性鞘脂类,可以作为有效工具发现心肌细胞自噬和凋亡关联的新因子。我们利用体外心肌细胞缺血模型结合基因芯片技术研究了 SPC调控的基因,发现MORN4及NR4A2受到SPC的调控,可能是调节心肌细胞自噬和凋亡的重要因子。MORN4(the membrane occupation and recognition nexus repeats 4 times)是包含4个MORN motif的蛋白。MORN motif广泛存在于动物、植物和原生生物的蛋白中,数量从2-17不等,但对其功能所知甚少。研究发现MORN motif与蛋白的膜定位有关,如 phosphatidylinositol phosphate kinase(PIPK)上的 MORN motif可将其定位在细胞膜上;而与叶绿体分裂相关的蛋白accumulation and replication of chloroplast(ARC3)通过MORN motif定位到类囊体膜上。目前有关MORN4的报道更少,仅限于参与果蝇光敏反应的研究,MORN4是否在缺血心肌中发挥功能还不清楚。NR4A2(Nuclear receptor subfamily 4,group A,member 2)也叫Nurr1,与NR4A1,NR4A3组成NR4A孤核受体家族。NR4A家族属即早期反应的转录因子,能够迅速对环境的改变做出反应。已有研究表明,NR4A2参与到肿瘤,肥胖,糖尿病,特别是神经类疾病的发生中,但是是否参与缺血性心脏病目前还不清楚。NR4A2在疾病中的功能与其调控分化,凋亡,迁移,增殖等有关,根据芯片结果我们推测NR4A2可能是参与心肌细胞凋亡的关键因子,目前,NR4A1参与细胞凋亡的研究已有较多报道,但是NR4A2与NR4A1在DNA结合区域和配体结合区域的不同使得两者功能不同,有关NR4A2的报道主要集中在肺癌细胞中,如:NR4A2在肺癌细胞中通过与p53结合抑制Bax的表达,抑制细胞凋亡。但是NR4A2是否参与心肌细胞的凋亡尚未见报道。基于以上问题,本论文研究了 MORN4及NR4A2在缺血心肌细胞自噬与凋亡中的作用,并进一步阐明了相关的作用机制。本论文的研究结果为缺血性心脏病的治疗提供了新的药物作用靶点。研究结果1.SPC通过JNK/MORN4/MFN2促进的自噬抑制缺血心肌细胞的凋亡1.1 SPC上调MORN4的表达去血清处理H9c2心肌细胞用以模拟心肌缺血的体内环境,并加入SPC检测MORN4的变化。Western blot及免疫荧光显示5 μM SPC明显上调MORN4的蛋白水平。荧光定量PCR验证了 5 μM SPC上调MORN4的RNA水平。因此,SPC能够上调MORN4的表达。1.2 MORN4在缺血心肌细胞和心梗心脏中的表达升高为了明确MORN4是否参与心肌细胞缺血过程,我们检测了 MORN4在缺血心肌中的表达。Western blot显示当缺血超过4 h时,伴随着凋亡maker PARP和caspase3切割的增加,MORN4的表达也显著上调。体内实验利用急性心梗模型进行验证,western blot结果表明,与对照组相比,心梗模型中心脏组织的PARP和caspase3的切割明显高于对照组,同时MORN4的表达明显升高。QPCR结果与蛋白水平变化一致。1.3干扰MORN4促进H9c2细胞和原代心肌细胞的凋亡为了明确MORN4在缺血心肌细胞凋亡中的作用,我们利用MORN4的干扰RNA抑制MORN4的表达。琼脂糖凝胶电泳,QPCR和免疫荧光结果表明80 nM的siRNA明显降低MORN4的表达。Western blot结果表明MORN4敲减后H9c2细胞和原代心肌细胞凋亡marker PARP与caspase3的切割都增加。TUNEL染色结果表明干扰MORN4后缺血导致的心肌细胞的凋亡进一步加剧。因此,干扰MORN4促进心肌细胞凋亡。1.4干扰MORN4抑制H9c2细胞和原代心肌细胞的自噬流我们进而利用MORN4的干扰RNA探究MORN4在缺血心肌自噬中的作用。干扰MORN4后,western blot结果显示心肌细胞LC3-Ⅱ蛋白水平明显升高;荧光显微镜下观察到转入EGFP-LC3的心肌细胞中LC3点状聚集明显增多。为了分析LC3-Ⅱ增多的原因,我们利用了自噬起始的抑制剂3-methyladenine(3MA)及自噬流的阻断剂bafilomycin A1(Baf A1)。由于3MA和BafA1均没有影响LC3-Ⅱ的蛋白水平,表明MORN4的siRNA通过阻断缺血心肌细胞的自噬流导致了 LC3-Ⅱ增多。1.5干扰MORN4通过阻断自噬流促进心肌细胞凋亡我们利用自噬流的阻断剂Baf A1和自噬促进剂Rapamycin确认MORN4敲减导致的自噬流阻断与细胞凋亡的关系。Western blot结果显示Rapamycin促进自噬后抑制了 MORN4敲减导致的心肌细胞凋亡,表明MORN4敲减导致的心肌细胞凋亡与自噬抑制有关;而Baf A1阻断自噬流并没有进一步影响心肌细胞凋亡的变化,表明MORN4敲减通过阻断自噬流进而抑制自噬促进心肌细胞凋亡。1.6 SPC通过MORN4抑制缺血心肌细胞的凋亡我们接下来利用MORN4的干扰RNA检测SPC是否通过MORN4保护心肌细胞凋亡。Western blot结果显示干扰MORN4后逆转了 SPC降低的PARP和caspase3的切割。因此,SPC通过MORN4保护心肌细胞凋亡。1.7SPC通过MORN4与mitofusion2(MFN2)的相互作用促进自噬Western blot结果表明缺血时MFN2的表达升高,为了明确MORN4是否通过MFN2调节自噬,首先检测了 MORN4对MFN2的影响,结果表明干扰MORN4抑制,而过表达MORN4促进MFN2的表达。Co-IP结果显示MORN4可以与MFN2直接结合。Western blot结果表明,SPC可以逆转MORN4敲减导致的MFN2的降低。因此,SPC可能通过MORN4与mitofusion2(MFN2)的相互作用促进自噬。1.8 SPC通过JNK促进MORN4表达,而MORN4负反馈调节JNK。SPC可通过JNK调节自噬,我们探究了 JNK与MORN4之间的关系。免疫荧光结果显示JNK磷酸化的抑制剂SP600125降低MORN4的表达,而western结果表明干扰MORN4后磷酸化的JNK升高。因此SPC通过磷酸化JNK促进MORN4的表达,而MORN4对JNK有负反馈调节。2.NR4A2通过促进自噬抑制缺血心肌细胞的凋亡2.1 NR4A2在缺血心肌细胞中的表达升高我们利用QPCR,western blot及免疫荧光检测了 NR4A2在缺血心肌细胞中的变化,发现NR4A2在去除血清的H9c2细胞中,mRNA水平和蛋白水平都有明显升高。2.2 NR4A2抑制缺血H9c2细胞和原代心肌细胞的凋亡为了探究NR4A2在缺血引发的心肌细胞凋亡中的作用,我们使用了 NR4A2干扰RNA和NR4A2过表达质粒,并利用QPCR及western blot对效果进行了验证。NR4A2敲减后,PARP和caspase3的切割明显高于对照组,TUNEL染色发现NR4A2敲减后,凋亡细胞明显增多;而过表达NR4A2能够减少缺血心肌细胞PARP和caspase3的切割。因此,NR4A2抑制缺血心肌细胞的凋亡。2.3干扰NR4A2抑制心肌细胞的自噬流为了明确NR4A2是否影响心肌细胞的自噬,我们利用NR4A2的siRNA抑制NR4A2的表达,western blot结果显示NR4A2敲减能上调LC3-Ⅱ水平;转入pEGFP-LC3之后,免疫荧光结果表明NR4A2敲减使LC3点状聚集增加,NR4A2过表达则使LC3-Ⅱ明显降低。我们进一步利用自噬流的阻断剂BafA1和NH4Cl以及自噬起始的抑制剂3MA验证NR4A2的作用,western blot结果表明NR4A2敲减抑制了缺血心肌细胞的自噬流。2.4干扰NR4A2通过抑制自噬流促进缺血H9c2细胞的凋亡为了明确NR4A2调节的自噬与凋亡是否相关,我们使用了自噬的抑制剂Baf A1,western blot显示PARP和caspase3切割没有进一步升高;而自噬促进剂Rapamycin加入后心肌细胞的PARP和caspase3切割明显被抑制。因此,干扰NR4A2通过阻断自噬流促进心肌细胞的凋亡。2.5 NR4A2通过p53/Bax抑制H9c2心肌细胞凋亡。为了检测NR4A2在H9c2心肌细胞中是否通过p53/Bax抑制心肌细胞凋亡,我们将NR4A2进行干扰或过表达,western blot结果表明NR4A2敲减后p53和Bax的表达都升高,而NR4A2过表达后,p53和Bax的表达都降低。co-IP结果显示p53能与NR4A2相结合,表明NR4A2通过p53/Bax抑制心肌细胞凋亡。免疫荧光结果表明NR4A2抑制了 p53在细胞核的定位,由于p53在细胞核中促进细胞自噬,表明NR4A2可能也通过p53调节自噬。2.6 MiR-212-3p 是 NR4A2/p53/Bax 的上游因子QPCR结果表明miR-212-3p在缺血时表达降低,而且软件预测发现MiR-212-3p能够靶向NR4A2,因此MiR-212-3p可能是靶向NR4A2的上游因子。QPCR 和 western blot 结果表明,MiR-212-3p 的 inhibitor 上调 NR4A2 RNA 和蛋白水平的表达,而mimics则抑制其表达,表明miR-212-3p能够调节NR4A2;双荧光素报告基因实验进一步验证miR-212-3p直接靶向NR4A2。而且,MiR-212-3p的inhibitor抑制缺血心肌细胞凋亡,抑制p53和Bax的水平,与NR4A2的作用一致。因此,miR-212-3p是NR4A2/p53/Bax的上游调节子。由上述结果我们得出结论:SPC能通过MORN4与MFN2相互结合促进自噬流抑制心肌细胞的凋亡,MORN4在缺血环境下应激性升高,对抗缺血引起的凋亡;NR4A2受到miR-212-3p调控,通过p53/Bax抑制缺血心肌细胞凋亡。