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目的: EphBs 受体及ephrinBs 配体存在于成年的大脑、脊髓及外周组织中,在各种生理和病理过程中具有重要的作用。我们及其他实验室的研究已经证明脊髓水平ephrinBs/EphBs 信号参与伤害性信息调制及中枢敏感化,但其下游机制仍不清楚。本研究目的在于探讨COX/PGE2/EP1 信号通路在脊髓水平ephrinBs/EphBs 激活引起的痛觉过敏中的作用。
方法:
1.观察鞘内注射ephrinB1-Fc 对脊髓COX-1 和COX-2 表达的影响。①鞘内注射ephrinB1-Fc(0.5μg,溶于5μl 生理盐水中),在注射后30 分钟,1,2,4,8,24 小时用Western blot 方法检测COX-1,COX-2 的表达,以探讨ephrinB1-Fc 鞘内注射后脊髓COX-1 和COX-2 表达的时间相。②鞘内注射不同剂量ephrinB1-Fc(0.02,0.1,0.5 μg,溶于5μl 生理盐水中),选择各自表达的高峰点,观察注射后8 小时COX-1 的表达和注射后2 小时COX-2 的表达,以探讨ephrinB1-Fc 鞘内注射后脊髓COX-1 和COX-2 表达的剂量依赖性。
2. 抑制COX-1,COX-2 或阻断EP1 受体对鞘内注射ephrinB1-Fc 引起的热痛觉过敏的影响。在鞘内注射ephrinB1-Fc(0.5 μg,溶于5μl 生理盐水中)前30 分钟,鞘内给予非选择性COX 抑制剂酮铬酸,COX-1 抑制剂SC-560(2μg,溶于5μl 生理盐水中)或COX-2 抑制剂SC-58125(2μg,溶于5μl 生理盐水中)或EP1 受体阻断剂SC-19220(2μg,溶于5μl 生理盐水中), 观察注射后30 分钟,1,2,4, 8,24 小时热辐射缩足潜伏期的改变。
3.抑制COX-1,COX--2 或阻断EP1 受体对鞘内注射ephrinB1-Fc 引起脊髓p-ERK和Fos 表达改变的影响。工具药注射的剂量和时间点同2,采用Western blot 方法检测ephrinB1-Fc 注射后30 分钟p-ERK 的表达,使用免疫荧光的方法检测ephrinB1-Fc 注射后90 分钟Fos 的表达。
结果:
1.鞘内注射EphB 受体激动剂ephrinB1-Fc 后30 分钟COX-1 蛋白的表达显著减少,1 小时达最低点,注射后4 小时恢复到基线水平。在注射后8 小时的检测时间点,COX-1 表达明显增加并至少维持到注射后24 小时。COX-2 蛋白的表达在ephrinB1-Fc 注射后30 分钟就开始增加,注射后2 小时达最高点,注射后4 小时恢复到基线水平。鞘内给予不同剂量的ephrinB1-Fc (0.02, 0.1, 0.5μg 溶于5μl 生理盐水中),在各自表达增加的高峰时间点,即COX-1 在注射后8 小时,COX-2 在注射后2 小时,均呈剂量依赖性增加脊髓COX-1 和COX-2 的表达。
2.鞘内给予非选择性COX 抑制剂酮铬酸或COX-1 抑制剂SC-560 或COX-2 抑制剂SC-58125 或EP1 受体阻断剂SC-19220,均能抑制鞘内注射ephrinB1-Fc 诱发的痛觉过敏。但在不同的时间点COX-1 抑制剂和COX-2 抑制剂效能有所不同。COX-2抑制剂在4 小时以内有显著作用,而COX-1 抑制剂在4 小时以后有显著作用,非选择性COX 抑制剂和EP1 受体阻断剂在全程作用均有显著作用。
3.鞘内注射ephrinB1-Fc 明显增加脊髓p-ERK 和Fos 的表达,这一效应能被预先鞘内给予非选择性COX 抑制剂酮铬酸或COX-1 抑制剂SC-560 或COX-2 抑制剂SC-58125 或EP1 受体阻断剂SC-19220 抑制。
结论: COX/PGE2/EP1 信号通路参与脊髓水平ephrinBs/EphBs 激活引起的痛觉过敏,其效应可能部分通过ERK 介导。