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研究目的: 本研究主要探讨转化生长因子–β1(Transforming Growth Factor–β1,TGF-β1)和溶血磷脂酸(Lysophosphatidic Acid,LPA)是否能诱导整合素αvβ6(Itgαvβ6)在肝癌细胞Hep3B2.1-7(Hep-3B)中过度表达,并对整合素β6(Itgβ6)基因的启动子区进行初步研究。 材料与方法: 首先,临床上收集肝癌患者的组织标本,每例标本进行连续切片,采用免疫组织化学方法检测Itgαvβ6的表达水平。然后,培养人肝癌细胞Hep-3B,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测其是否表达Itgαvβ6。再分别用TGF-β1或/和LPA刺激Hep-3B细胞,利用实时定量PCR(Real-time PCR)方法检测Hep-3B中Itgαvβ6的mRNA表达水平,利用蛋白质印迹法(Western Blot)方法检测Hep-3B中Itgαvβ6的蛋白表达水平;同时,利用Itgβ6基因转录起始位点附近1135bp基因序列经PCR进行不同长度的缺失扩增,并连接到载体质粒pGL2-basic,构建重组质粒,利用双荧光素酶报告基因分析系统检测启动子区在TGF-β1和LPA诱导下的转录活力,最后利用Transcription Element Search System(TESS)预测Itgβ6基因主要转录调控区潜在的转录因子结合位点。 结果: 1.免疫组织化学检测:整合素αvβ6在肝细胞癌组织标本中呈高表达,而在正常肝脏组织中并不表达。 2.RT-PCR检测:Hep-3B细胞表达整合素αvβ6,在正常肝细胞(HL-7702)却未发现表达。 3.Real-timePCR检测:TGF-β1、LPA和TGF-β1+LPA均可诱导Hep-3B细胞过度表达整合素αvβ6:TGF-β1刺激组整合素αvβ6在mRNA水平的表达(1.947±0.1953)较对照组(1.041±0.1029)增加,有统计学意义(p<0.05);LPA刺激组整合素αvβ6在mRNA水平的表达(2.085±0.2046)较对照组(1.041±0.1029)增加,有显著统计学意义(p<0.01);TGF-β1+LPA刺激组整合素αvβ6在mRNA水平的表达(4.717±0.2759)较对照组(1.041±0.1029)增加,有显著统计学意义(p<0.01)。 4.WesternBlot检测:以GAPDH作为内参基因,TGF-β1刺激组整合素αvβ6在蛋白质水平(2.680±0.1524)较对照组(1.000±0.07876)增加,有统计学意义(p<0.05);LPA刺激组整合素αvβ6在蛋白质水平的表达(2.764±0.1313)较对照组(1.000±0.07876)增加,有统计学意义(p<0.05);TGF-β1+LPA刺激组整合素αvβ6在蛋白质水平(4.293±0.3847)较对照组(1.000±0.07876)增加,有显著统计学意义(p<0.01)。 5.质粒构建:重组质粒pGLB-100、pGLB-207、pGLB-359、pGLB-630、pGLB-1135、pGLB-A、pGLB-B和pGLB-C经DNA测序报告显示与Genbank中序列完全吻合。 6.双荧光素酶报告基因分析系统检测:重组质粒pGL2-Basic、pGLB-100、pGLB-207、pGLB-359、pGLB-630和pGLB-1135在Hep-3B细胞中的活性分别为0.1572±0.01142,0.1787±0.02194,0.3786±0.04136,1.078±0.08542,2.175±0.2625,1.000±0.09335(pGLB-1135的荧光值为1);在-458/-187这个区域,启动子活性明显下降。对458/-187这个区段的基因序列进行亚克隆,再构建三个质粒,分别命名为pGLB-A、pGLB-B和pGLB-C,3种重组质粒在Hep-3B细胞中的活性分别为:111.996±3.185,84.627±2.551,105.875±1.310。重组质粒pGLB-C的活性较pGLB-A无明显改变,故-326bp/-157bp区为整合素β6基因启动子的主要调控区。 7.(TESS)在线预测:-326bp/-157bp区之间序列进行生物信息学分析,在该区域潜在的转录因子结合位点有:AP-1、c-Myb、HNF-1/HNF-1B、SRF和YY1。 8.TGF-β1和LPA增强整合素β6基因启动子区的转录活性:在TGF-β1或LPA的刺激下,重组质粒pGLB-C在Hep-3B细胞中的活性较对照组显著增强(p<0.001)。 结论: 1.整合素αvβ6在肝细胞癌组织标本及Hep-3B细胞中呈高表达。 2.TGF-β1和LPA可能通过结合AP-1、c-Myb、HNF-1/HNF-1B、SRF或YY1等转录因子结合位点,从而激活整合素β6基因的启动子区,最终诱导整合素αvβ6在Hep-3B细胞中过度表达,这将有望为肝细胞癌的诊断和治疗提供新的潜在治疗靶点。