本实验室以前的研究发现,水稻ZFRGl(ZFP252 Regulated Gene 1)是典型的RING finger E3泛素连接酶,ZFRG1干涉抑制表达转基因植株能够显著提高水稻的耐盐和抗旱性,推测ZFRG1可能在水稻响应非生物胁迫的过程中发挥了负调控的作用,为了进一步的阐明ZFRG1参与水稻千旱和高盐胁迫耐性作用机制,利用酵母双杂交技术筛选到两个包含NAM保守结构域的互作蛋白ZRIP1(ZFRG1 Interacting Protein 1)和ZRIP2(ZFRG1 Interacting Protein 2),并利用酵母双杂交“一对一”、GST pull-Down验证其体内、体外互作反应(方慧敏,2014)。本文通过分子生物学、生物化学和遗传学技术手段在此基础上对水稻RING型E3泛素连接酶基因ZFRG1的生物学特性进行分析,并对酵母双杂交筛选到的两个互作蛋白ZRIP1和ZRIP2的功能做了初步分析,主要结果如下:pZFRG1:GUS转基因植株的GUS组织化学染色结果表明,在幼穗和小花中ZFRG1基因表达量相对较高。水稻原生质体转染和烟草叶片瞬时表达的ZFRG1的亚细胞定位结果显示,ZFRGI定位在细胞膜和细胞核中。用ABA处理ZFRG1转基因种子,结果表明,ZFRG1的干涉抑制显著提高了其对ABA敏感度。免疫共沉淀、BiFC(Bimolecular fluorescence complementation)等验证 ZFRG1 与 ZRIIP1 蛋白互作,烟草叶片瞬时表达亚细胞定位结果显示ZRIP1定位在细胞膜和细胞质中,ZFRG1与ZRIP1共定位的结果发现ZFRG1能够与ZRIP1细胞膜共定位。体外泛素化实验证明了 ZFRG1能够泛素化ZRIP1。利用qRT-PCR方法对ZRIP1的表达特性分析,结果表明,ZRIP1在水稻成株期的各个组织中均有表达,其中在叶和茎中的表达量最高;同时非生物胁迫诱导表达分析显示,ZRIP1能够受到盐胁迫(100mM NaCL)和ABA(50μM)的诱导。通过农杆菌介导的方法获得了 ZRIP1的过表达水稻转基因植株,并对其进行了生物学功能分析。研究结果表明,过量表达ZRIP1转基因植株种子在萌发后期对外源ABA和盐的敏感度均低于野生型,而过量表达ZRIP1转基因植株苗期对盐和PEG的敏感度却高于野生型。免疫共沉淀、BiFC(Bimolecular fluorescence complementation)等验证 ZFRG1 与ZRIP2蛋白互作,烟草叶片瞬时表达亚细胞定位结果显示ZRIP2定位在细胞膜和细胞质中,ZFRG1与ZRIP2共定位的结果发现ZFRG1能够与ZRIP2细胞膜共定位。利用qRT-PCR方法对ZRIP2的表达特性分析,结果表明,ZRIP2在水稻成株期的各个组织中均有表达,其中在叶和叶鞘中的表达量最高;同时非生物胁迫诱导表达分析显示,ZRIP2能够受到ABA(50μM)的诱导。通过农杆菌介导的方法获得了 ZRIP2的过表达水稻转基因植株,分析表明,ZRIP2的过量表达转基因植株对外源ABA的敏感度随着ABA浓度的增加敏感度也随之增加,同时分析了 ABL突变体中ABA(50μM)对ZRIP2的诱导表达。盐敏感试验表明,ZRIP2的过表达与ZFRG1干涉转转基因植株在萌发后期均显著降低了对盐的敏感性。非生物逆境胁迫严重影响作物的生长发育,制约全球农业生产。水稻是世界上主要的粮食作物,提高水稻耐(抗)非生物胁迫能力对稳定水稻单产、保障粮食供给至关重要。由泛素介导的26S蛋白酶体途径在翻译后修饰调控植物生长发育过程中起着重要的作用,其功能主要涉及植物光形态建成、新陈代谢调控、激素信号转导和DNA损伤修复等多个过程,越来越多的证据表明泛素介导的26S蛋白酶体途径也参与到植物响应非生物逆境胁迫。本课题在前期研究的基础上,对ZFRG1及其两个NAC蛋白的互作反应进行验证,并对其生物学特性和功能做了初步分析,结果表明,ZFRG1通过与ZRIP1的互作在翻译水平上对其进行修饰进而影响其生物学功能来调控水稻的干旱胁迫响应过程;同时可能通过与一个干旱高盐胁迫响应的正调节因子ZRIP2互作来调控植物响应非生物胁迫的耐逆机制。