NK细胞是机体天然免疫的关键组分,占外周淋巴细胞的5~10%。它是机体免疫防御的第一道防线,在早期恶性转化的细胞、病毒和胞内寄生菌、真菌的清除以及母胎界面的形成中具有关键作用。NK细胞的这些作用既可通过直接的细胞毒杀伤作用,也可通过其分泌的细胞因子如IFN-γ等参与调控适应性免疫而实现。小鼠NK细胞的发育主要源自于骨髓的造血干细胞,经共同淋巴祖细胞向NK祖细胞分化(precursor NK,pNK,CD122+NK1.1-DX5-)。p NK通过不成熟NK细胞(immature NK,i NK,CD122+NK1.1+DX5-)向成熟NK细胞(mature NK,mNK,CD122+NK1.1+DX5+)发育。当小鼠NK细胞获得表面标志NK1.1分子后,根据表面受体CD11b和CD27的表达水平,依次由CD11b-CD27+向CD11b+CD27+而最终形成CD11b+CD27-终末成熟NK细胞。NK细胞发育与功能的正常发挥依赖于内源性、外源性因子;正向、负向转录因子的相互平衡。外源性因子主要包括正向的介素-15(IL-15)和负向的转化生长因子-β(TGF-β),而内源性的转录因子主要包括调控NK细胞早期发育、促进pNK形成的Ikaros,Pu.1,Ets1和维生素D3调节蛋白1(VDUP-1);促进i NK形成的E4BP4,Id2和MEF;促进NK细胞终末成熟的GATA3、Tbx21、Eomes和Irf2。但是目前这些发现的转录因子均为正向调控NK细胞发育与成熟,而对NK细胞的内源性负性调控因子的认识仍处于初始阶段。作为调控NK细胞终末成熟关键的转录因子,Tbx21基因敲除小鼠(Tbx21-/-)终末期CD11b+CD27-NK细胞亚群几乎缺失,但其上游信号通路目前知之甚少。NK细胞是细胞因子IFN-γ的主要细胞来源,而IFN-γ在机体抵抗病毒入侵和肿瘤发生中具有重要作用。NK细胞IFN-γ分泌缺陷与肿瘤、感染易感性呈正相关。利用IL-2、IL-12等细胞因子刺激NK细胞或人重组IFN-γ增加体内IFN-γ水平进行临床肿瘤治疗的探索,虽有一定的治疗效果,但由于其严重的毒副作用而令人失望。因此寻找新的化合物激活NK细胞产生IFN-γ而降低其体内毒性具有非常重要的临床意义。基于上述我们提到的NK细胞发育与功能调控研究领域中的两个关键问题,我们从内源性因子-转录因子foxo1和外源性因素-天然化合物phyllanthusminc(pl-c)两个方面,深入探讨nk细胞发育与功能的调控新机制,并寻找激活nk细胞ifn-γ分泌的新策略、新分子。方法与结果:1.foxo1对nk细胞发育与功能的调控作用及相关机制研究foxo1在细胞代谢、细胞周期、凋亡、自噬和抗氧化应激等方面具有重要作用。近期研究发现foxo1参与造血干细胞、共同淋巴祖细胞的生成,以及t、b细胞的发育与功能的调控,且在不同细胞中对靶基因的调控作用具有高度的细胞背景特异性。但是其在nk细胞中的作用目前尚未见研究报道。我们通过一系列的体内、外模型研究发现:(1)foxo1缺陷减少了nk细胞向外周淋巴节的归巢,其机制可能与cd62l低表达有关为了研究foxo1对nk细胞发育与功能的影响,我们首先通过ncr1icre小鼠与foxo1fl/fl小鼠(含有floxedfoxo1等位基因)杂交构建了nk细胞foxo1特异性敲除(foxo1?nk)的小鼠模型。foxo1敲除后对骨髓、脾脏中nk细胞的比例、数量无明显影响,但是显著降低外周淋巴结nk细胞的比例和数量,且显著降低淋巴细胞归巢关键因子cd62l的表达。(2)foxo1以干细胞内源性的方式抑制nk细胞终末成熟foxo1?nk小鼠骨髓、脾脏、外周淋巴结和外周血终末成熟cd11b+cd27-nk细胞比例明显增加,cd27表达降低,且终末成熟cd43+klrg+nk细胞比例增加。通过骨髓移植将野生型小鼠或foxo1?nk小鼠骨髓细胞移植至cd45.1同背景野生型小鼠中我们发现foxo1抑制了nk细胞成熟的动力学过程。而通过将野生型小鼠和foxo1?nk小鼠骨髓细胞以等比例的方式移植至同一rag2-/-il2rg-/-小鼠体内构建嵌合体小鼠发现foxo1以干细胞内源性的方式调节nk细胞的成熟。(3)foxo1抑制nk细胞ifn-γ分泌和肿瘤直接靶向杀伤作用foxo1?nk小鼠脾脏细胞在体外被il-12与il-18联合刺激后分泌ifn-γ的nk细胞比例无明显改变,但单个nk细胞分泌ifn-γ强度明显增加;人nk细胞株nkl无论是持续过表达、可诱导性表达或敲低foxo1均以相同的方式影响ifn-γ的生成。foxo1敲除显著升高小鼠nk细胞对yac-1的体外直接靶向杀伤作用,而过表达foxo1显著抑制nkl细胞对靶细胞k562的直接靶向杀伤作用。体内实验进一步证实foxo1敲除明显抑制了小鼠b16f10细胞在体内向肺脏转移的现象。(4)促炎因子或肿瘤刺激促进nk细胞foxo1的磷酸化而使其失活foxo1磷酸化后从细胞核向胞浆转移而失去其转录活性。nk细胞发育与功能的关键细胞因子il-2、il-12和il-15迅速诱导人nk92细胞和小鼠nk细胞foxo1磷酸化。同时发现小鼠b16f10黑色素瘤细胞体内接种1周后肺脏nk细胞foxo1磷酸化水平明显增高。(5)机制研究上发现foxo1直接结合人tbx21dna启动子区域而通过与sp1的蛋白相互作用间接结合到小鼠tbx21dna启动子sp1的结合位点而抑制sp1对tbx21表达的促进作用。我们发现foxo1mrna和蛋白表达随着小鼠nk细胞的成熟依次降低而tbx21的表达方式与其恰恰相反。foxo1敲除后小鼠nk细胞tbx21mrna和蛋白表达显著增高,而nkl细胞过表达或敲低foxo1均可负向调节tbx21的表达。通过chip实验发现在人nk细胞中foxo1可直接结合到tbx21启动子区域forkhead共有序列上,而通过ip和chip实验发现小鼠nk细胞中foxo1只能以间接的方式被转录因子sp1招募至tbx21近端启动子sp1的dna结合区域而实现对tbx21表达的抑制作用。(6)通过遗传学方式证实foxo1对nk细胞成熟的抑制作用必需通过其对tbx21表达的抑制性调节为了进一步研究foxo1对nk细胞成熟的抑制作用与tbx21的关系,我们通过遗传学手段将foxo1?nk小鼠与tbx21-/-杂交,获得tbx21-/-和tbx21+/-foxo1缺陷小鼠,即tbx21-/-foxo1?nk(tbx21敲除纯合子,无tbx21表达)和tbx21+/-foxo1?nk(tbx21敲除杂合子,tbx21低表达)。通过对上述小鼠nk细胞成熟状态的分析我们发现在有tbx21存在的情况下(无论是野生型还是tbx21杂合子小鼠),foxo1敲除(tbx21+/-foxo1?nk小鼠)可促进nk细胞终末成熟,但当tbx21缺失的情况下(即tbx21纯合子小鼠,无tbx21表达),foxo1敲除(tbx21-/-foxo1?nk小鼠)对nk细胞的成熟则无明显影响。这说明foxo1抑制nk细胞成熟必需通过抑制tbx21的表达。2.天然化合物pl-c促进人nk细胞ifn-γ分泌及相关机制研究为了寻找更多的nk细胞激活途径,改善目前临床上提高体内ifn-γ水平的治疗策略的毒副作用,本论文通过对近50多种天然化合物单体进行筛选,我们发现了一个源自木酚素植物提取物的小分子化合物phyllanthusminc(pl-c)可显著增加人nk细胞ifn-γ的分泌。(1)pl-c促进人cd56bright和cd56dimnk细胞ifn-γ转录和分泌在细胞因子il-12、il-15存在或不存在的情况下,pl-c均可增加健康人外周血外周单个核细胞(pmbc)、富集nk细胞中ifn-γ+nk细胞比例;通过纯化的nk细胞(≥99.5%)进一步分析发现,在il-12、il-15存在或不存在的情况下pl-c均可直接促进cd56bright和cd56dimnk细胞ifn-γmrna合成和蛋白分泌,且与il-12具有协同效应。(2)pl-c对人nk细胞直接靶向杀伤作用及t细胞ifn-γ分泌均无明显影响为进一步研究pl-c对nk细胞杀伤功能的影响,我们采用纯化nk细胞进行体外靶细胞直接杀伤实验分析。我们发现nk细胞在il-12或il-15存在的情况下,pl-c对nk细胞高毒性的靶细胞k562或低毒性作用的多发性骨髓瘤细胞株arh-77的直接细胞杀伤作用均无明显影响。为了分析pl-c对人nk细胞ifn-γ分泌是否具有细胞特异性,我们接下来观察了在il-12或il-15存在的条件下,pl-c对cd4+和cd8+t细胞的ifn-γ分泌是否有促进作用。结果发现pl-c对cd4+和cd8+tifn-γ+细胞比例无显著影响。(3)pl-c通过nf-κb信号通路促进nk细胞ifn-γ分泌为进一步研究pl-c促进nk细胞ifn-γ分泌的机制,我们综合分析了既往报道的参与nk细胞ifn-γ分泌的主要信号通路。我们发现在il-12或il-15存在的情况下,pl-c对il-12、il-15的受体(il-12rβ1、il-12rβ2、il-15rα、il-15rβ)及其下游信号通路t-bet、stat家族等蛋白均无显著影响。而不论il-12、il-15是否存在,pl-c均可显著促进nf-κbp65的磷酸化,而对p65mrna和总蛋白的表达无明显影响。且nf-κb特异性抑制剂甲苯磺酰基-l-苯丙氨酸氯甲基酮(tpck)可显著抑制pl-c对人原代nk和细胞株nkl细胞ifn-γ分泌的促进作用。通过凝胶电泳迁移率实验(emsa)和染色质免疫共沉淀(chip)实验进一步分析发现pl-c可显著促进p65结合到ifngdna启动子c3-33pκb位点上。(4)tlr-nf-κb信号轴介导pl-c对nk细胞ifn-γ分泌的促进作用在免疫细胞接受外界因子刺激后tlr-nf-κb信号轴对大量细胞因子的产生具有重要作用,而nk细胞中表达较高水平的tlr1、tlr3和tlr6。为进一步分析toll样受体(tlr)在pl-c促进nk细胞ifn-γ分泌中的作用,我们采用了抑制性抗体阻滞tlr信号、tlr激动剂、双荧光素酶报告基因系统和tlr1shrna等方法证实了tlr介导的nf-κb激活。通过使用tlr1、tlr3或tlr6抗体来阻断tlrs信号,我们发现tlr1、tlr6抗体可显著抑制pl-c对nk细胞ifn-γ分泌的促进作用和p65磷酸化。pl-c还可促进tlr1/2和tlr6激动剂对nk细胞ifn-γ分泌的激动作用。在hek293t细胞中构建同时过表达tlr1或tlr6、pgl-3κb-luc报告质粒系统,我们发现pl-c可直接通过tlr1或tlr6增加nf-κb对κb位点的结合,且有一定的剂量依赖趋势。通过shrna敲低nkl细胞中tlr1的表达可抑制pl-c对ifn-γ分泌的促进作用,这一发现进一步明确了pl-c激活tlr-nf-κb信号轴在促进nk细胞ifn-γ分泌中的作用。研究结论:1.foxo1对nk细胞发育与功能的调控及机制:1)foxo1缺陷导致cd62l低表达而损伤nk细胞向外周淋巴节的归巢;2)foxo1负向调控nk细胞终末成熟而对nk细胞的早期成熟无明显影响;3)foxo1抑制nk细胞的ifn-γ分泌功能和肿瘤细胞靶向杀伤作用;4)foxo1磷酸化介导了促炎因子或肿瘤细胞激活nk细胞过程中的foxo1转录活性失活,从而释放foxo1对nk细胞发育与功能的抑制效应;5)通过构建foxo1敲除、tbx21半敲除或者全敲的动物模型,证实foxo1对nk细胞的成熟的抑制作用必需通过其对tbx21的抑制性调节而实现;6)在人nk细胞中foxo1直接结合tbx21dna启动子区域forkhead共有序列而在小鼠nk细胞中foxo1被sp1招募到小鼠tbx21启动子sp1的dna结合位点而抑制sp1对tbx21的转录起始作用。2.天然化合物pl-c通过tlr-nf-κb通路选择性促进人nk细胞ifn-γ分泌1)pl-c促进人cd56bright和cd56dimnk细胞ifn-γ转录和分泌且与il-12具有协同效应,但不影响nk细胞杀伤及t细胞的ifn-γ分泌功能;2)pl-c对il-12和il-15的受体及其下游信号通路无明显作用;3)pl-c通过直接激活tlr-nf-κb信号通路而促进nk细胞ifn-γ分泌。总之,通过上述两部分实验,我们发现了首个负性调控nk细胞终末成熟和功能的内源性转录因子foxo1,且证实了其机制主要是通过且必需通过其对nk关键转录因子tbx21表达的抑制性调节而实现,极大的丰富了nk细胞发育与功能的负性调控网络;另一方面我们发现了一个特异性激活nk细胞inf-γ分泌功能而不影响nk细胞杀伤功能的天然小分子化合物PL-C,且阐明了其机制是通过其对TLR-NF-κB轴的激动作用而实现的,为基于INF-γ的临床治疗策略提供了一个新的可供探索的途径。