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鸭Ⅰ型病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus, DHV)引起的雏鸭的一种急性、高度致死性传染病,其特征以肝坏死为主。将肝组织病料碾磨液上清,接种BHK-21细胞,盲传3代后,该病毒可使BHK-21细胞病变,将细胞培养物裂解上清经浓缩、负染后电镜观察可见直径约30nm,无囊膜的球形病毒粒子;间接免疫荧光试验结果表明,该分离株与Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清反应发出强特异性荧光;以特异性引物对分离的病毒进行RT-PCR,扩增出一条238bp的单一条带,序列比对分析也表明与已知DHV-Ⅰ序列同源性97.1%。结果表明,该分离株为鸭Ⅰ型肝炎病毒株,暂命名为ZJ-V/2006。实践证明,反向遗传学技术是深入开展RNA病毒分子生物学以及病毒致病机理等方面研究的最有效手段。我们利用基因工程技术在国内外首次建立了DHV-Ⅰ的反向遗传学操作系统,在体外实施DHV-Ⅰ的遗传拯救,并系统研究拯救病毒的生物学特性。1.根据DHV-ⅠZJ-V/2006株全基因组序列设计并合成5对特异引物,进而应用RT-PCR技术分5段扩增了DHV全基因组cDNA。将扩增的cDNA重叠片段A、B、C和DE片段分别克隆到载体pBluescriptⅡK S (+)中,获得了DHV全长基因组cDNA克隆pBLDHV。在扩增5′末端时,引入ApaⅠ酶切位点和SP6启动子序列;在基因组3′末段PolyA尾引入NruⅠ酶切位点,以供cDNA模板的线性化之用。核酸序列分析表明, DHV-Ⅰ毒株基因组全长为7 711个核苷酸,与DHV-ⅠZJ-V BHK-21细胞分离株的同源性为99.9 %;全长基因组中有6个核苷酸发生突变,均未导致对应的氨基酸发生改变,为沉默突变。2.我们利用NruⅠ将pBLDHV线性化后,以之为模板,利用SP6 RNA聚合酶系统在体外进行转录,获得病毒RNA。再通过脂质体介导法,将转录物RNA导入BHK-21细胞。观察致细胞病变(CPE)产生情况。观察结果表明,转染24h后,可在显微镜下看到DHV-Ⅰ的致细胞病变的效应,细胞表现为形态变圆、聚堆、折光率增大等现象;48h,CPE变得更加明显,并有细胞脱落现象;72h,70%的细胞脱落,收集细胞培养物。随后,再分别使用RT-PCR方法、限制性内切酶消化法、间接免疫荧光技术以及电镜观察等方法,对拯救病毒进行了综合鉴定。研究结果证明,在电镜下可观察到典型的病毒颗粒,直径在30nm左右;拯救病毒能与DHV-Ⅰ的阳性血清反应;从拯救病毒的核酸抽提物中不仅能扩增出DHV-Ⅰ的特异性基因组序列,而且用EcoRⅠ可切开PCR扩增产物,从而证明,我们获得的病毒是拯救病毒,而非污染了母本病毒。综上所述,我们在体外成功拯救到了DHV-Ⅰ。3.在上述研究基础上,我们又系统研究了拯救病毒(rDHV-Ⅰ)在BHK-21细胞中的生物学特性及增殖特征等。首先,用半数组织感染量(TCID50)法测定了rDHV-Ⅰ的滴度,并绘制了一步生长曲线,结果表明与DHV-Ⅰ在BHK-21细胞中的滴度相似,具有相近的增殖动力学特征。实时定量RT-PCR检测结果表明,rDHV-Ⅰ不仅能在BHK-21细胞中进行高水平复制,而且RNA的拷贝数与培养时间具有相关性,在接毒后病毒RNA的拷贝数逐渐增加,到第48 hr,RNA的拷贝数达到峰值(3.27×109拷贝/mL) ,随后病毒基因组的拷贝数逐渐降低。此外,通过毒力试验也证明了rDHV-Ⅰ与母本病毒在引起的临床症状没有明显不同,生存曲线也相似。结果表明,我们已利用反向遗传学技术在体外成功拯救到了DHV-Ⅰ,而且这种人工拯救病毒具有与母本毒具有相似的分子生物学特征。4.为了建立一种有效快速检测DHV-Ⅰ的方法,我们根据DHV-Ⅰ基因组中最保守的编码RNA依赖RNA聚合酶(RdRP)的3D基因,在其保守区设计合成了1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ模式的实时荧光定量PCR方法,用于检测DHV-Ⅰ。以pMD-3D质粒为阳性对照制作标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。用该方法检测DBHV、DEDSV、DPMV、DPV、DRV和RA均呈阴性,表明该方法特异性良好;敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1 TCID50 / 0. 1 mL;对20份临床疑似的DHV-Ⅰ病料的检测结果显示,该方法与病毒分离的符合率为100%。从而表明,建立的DHV-ⅠSYBR GreenⅠP CR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。我们建立的这种快速、敏感和特异的rPCR将为DHV-Ⅰ的临床检测,体内分布模式和分子流行病学调查提供一种强有力的工具。综上所述,我们成功地用BHK-21细胞分离得到了DHV-Ⅰ,命名为ZJ-V/2006株;首次成功构建了该毒株的感染性克隆cDNA;系统研究了该拯救病毒以及其衍生病毒的生物学特性;成功建立了一种DHV-Ⅰ快速准确的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法。这些的研究成果将为从细胞水平、分子水平上探讨DHV-Ⅰ的生物学特性、致病机理、鸡胚传代毒力减弱机理、新型疫苗以及分子流行病毒学调查等方面的研究提供了良好的技术平台。