食管癌是一种恶性度极高的肿瘤,位于全球肿瘤发病的第八位,肿瘤死亡的第四位。据报道中国是世界上食管癌发病率（21/10万）和死亡率（15.02/10万）最高的国家。食管癌从发病到晚期是一个漫长的演变过程。众所周知,早诊早治对食管癌的治愈和预后是非常有益的。因而,早诊早治以提高食管癌病人的五年生存率成为目前研究的重要课题。食管癌的地区分布差异和高发区明显的家族聚集现象提示遗传因素在该病的发生中起着重要的作用。近年来,国内外研究者发现了一个新的与肿瘤密切相关的基因家族,即CCN家族。Cyr61是CCN基因家族的成员之一,是一种血管生成因子。它是与细胞表面以及胞外基质蛋白相关的一种富含半胱氨酸的分泌型蛋白质,可介导细胞粘附,刺激细胞迁移,增强成纤维细胞和内皮细胞中生长因子诱导的DNA的合成,且可促进间质中软骨的形成。最重要的是在免疫缺陷小鼠体内,其表达可促进人肿瘤细胞形成肿瘤,并促进新生血管的形成。Cyr61在肿瘤形成中的作用已成为国内外研究热点,已有报道显示:Cyr61在乳腺癌、胰腺癌、胃癌和卵巢癌中出现过表达,而在肝癌、多形性胶质母细胞瘤、肺癌、子宫内膜癌、前列腺癌和平滑肌瘤中的表达则降低。但是有关Cyr61在食管癌中的研究却很少。本课题采用实时荧光定量PCR和免疫组化法测定了Cyr61基因在食管癌原发灶及其匹配的正常食管组织中的mRNA和蛋白的表达水平,研究了其与临床病理参数之间的关系,并对食管癌患者进行了术后随访,探讨了Cyr61对病人预后的影响。材料与方法1对象的选择、组织样本的采集与资料的收集选取2004年至2007年在郑州大学第一附属医院和河南省林州市肿瘤医院就医的食管癌患者作为研究对象,采集术后患者食管癌原发灶及其匹配的正常食管组织标本（经病理学鉴定）186对。标本采集后立即放入液氮中,然后放在-80℃冰箱中冷冻保存。收集病人的性别、年龄、家族史、淋巴结转移、病理类型、肿瘤位置、肿瘤大小、病理分级、浸润深度以及临床分期等方面的资料,用于统计分析和研究。2样本中Cyr61 mRNA水平的测定采用荧光定量PCR测定食管癌患者癌组织及其匹配的正常组织Cyr61 mRNA的表达水平。通过测定样本中目的基因模板的Ct值来反映模板的含量。3样本中Cyr61蛋白水平的测定通过免疫组织化学染色法测定食管癌患者癌组织及其匹配正常组织Cyr61蛋白的表达水平,每一标本在200倍显微镜下观察3个染色最强的视野,记数阳性细胞数,并计算阳性细胞百分比,食管癌组织中阳性细胞百分比与正常食管组织中阳性细胞百分比的比值作为Cyr61蛋白表达水平指标。4生存分析2008年3月至4月期间,对研究对象进行随访。患者手术治疗作为生存的起始事件,随访时间作为观察的终止时刻,以死亡作为终点事件,终点事件与起始事件之间的时间间隔定义为患者的生存时间。5统计学分析运用SPSS12.0统计分析软件对数据进行分析,对每一个标本,用ΔCt(Ct_Cyr61-Ct_β-actin)值表示目的基因与内参基因β-actin间Ct值的差值,Δ（ΔCt）值为ΔCt_{正常食管组织}与ΔCt_{食管癌组织}的差值。对mRNA和蛋白表达水平采用配对样本t检验。采用x²检验和LSD t-test分析186例食管癌样本Cyr61 mRNA和蛋白的表达水平与临床病理参数的关系,绘出Cyr61基因的表达阳性与阴性的食管癌病人的Kaplan-Meier生存曲线,采用Log-rank（时序检验）来分析两条曲线的差异。采用Cox回归分析临床参数与基因表达对生存的影响。以α=0.05作为检验水准。结果1实时荧光定量PCR结果1.1 Cyr61 mRNA在食管癌组织及其匹配的正常食管组织中的表达水平实时荧光定量PCR结果显示,在186例样品中,Cyr61 mRNA在74.2%（138/186）的食管癌组织中表达上调。配对t检验显示,食管癌组织与其匹配的正常食管组织相比,Cyr61 mRNA的表达差异有统计学意义（t=5.695,p＜0.01）。1.2 Cyr61 mRNA与食管癌临床参数及相关因素的关系Cyr61 mRNA在不同体积和不同分化程度肿瘤中的表达水平差异有统计学意义（x²=18.963,p＜0.01;x²=9.775,p＜0.01）。Cyr61 mRNA的表达与浸润深度之间也具有显著的相关性（x²=29.255,p＜0.01）。淋巴结转移组食管癌组织中Cyr61 mRNA的表达显著高于淋巴结未转移组（x²=12.959,p＜0.01）。LSD t-test分析显示:在体积大于100cm³肿瘤中的表达水平显著高于体积小于50cm³肿瘤中的表达水平（p＜0.01）;在浸润纤维膜组以及深肌层组的肿瘤中的表达水平显著高于浸润浅肌层组（p＜0.01,p＜0.01）。2免疫组化结果2.1 Cyr61蛋白在食管癌组织中及其匹配的正常食管组织中的表达配对t检验结果显示,食管癌组织中Cyr61蛋白的表达水平显著高于其匹配的正常食管组织（t=33.047,p＜0.01）,与荧光定量PCR结果相一致。2.2 Cyr61蛋白与食管癌临床参数及相关因素的关系有肿瘤家族史人群的Cyr61蛋白表达水平显著高于无肿瘤家族史人群的表达水平（x²=5.367,p＜0.05）。Cyr61蛋白在不同体积和不同分化程度肿瘤中的表达水平差异有统计学意义（x²=6.847,p＜0.05;x²=18.003,p＜0.01）。Cyr61蛋白的表达与浸润深度之间也具有显著的相关性（x²=17.679,p＜0.01）。淋巴结转移组食管癌组织中Cyr61蛋白的表达显著高于淋巴结未转移组（x²=18.001,p＜0.01）。Cyr61蛋白在吸烟人群中的表达水平显著高于不吸烟人群的表达水平（x²=5.807,p＜0.05）。LSD t-test分析显示:在体积大于100cm³以及体积在50～100cm³肿瘤中的表达水平显著高于体积小于50cm³肿瘤中的表达水平（p＜0.01,p＜0.05）;Cyr61蛋白在低分化肿瘤中的表达水平显著高于在高分化肿瘤中的表达水平（p＜0.01）;在浸润纤维膜组以及深肌层组的表达水平显著高于浸润到浅肌层组的表达水平（p＜0.01,p＜0.05）。3生存分析单变量生存分析显示,男性患者的平均生存时间为35个月,女性患者为42个月,男性患者显著低于女性患者（p＜0.05）。吸烟组的平均生存时间为34个月,不吸烟组为41个月,吸烟组显著低于不吸烟组（p＜0.01）。有肿瘤家族史患者的平均生存时间为33月,无家族史组为40个月,前者显著低于后者（p＜0.01）。肿瘤体积大于100cm³、50～100cm³之间以及小于50cm³患者的平均生存时间分别为34个月、38个月和39个月,三组之间差异有统计学意义（p＜0.05）。高分化、中分化以及低分化肿瘤患者的平均生存时间分别为41个月、39个月和33个月,三组之间差异有统计学意义（p＜0.01）。肿瘤浸润浅肌层、深肌层以及纤维膜的患者的平均生存时间分别为42个月、33个月和36个月,三组之间差异有统计学意义（p＜0.01）。另外,有淋巴结转移患者的平均生存时间为34个月,无淋巴结转移患者为42个月,前者显著低于后者（p＜0.01）。Cyr61 mRNA高表达患者的平均生存时间为33个月,低表达患者为42个月,前者显著低于后者（p＜0.01）。Cyr61蛋白高表达患者的平均生存时间为33个月,低表达患者为44个月,前者显著低于后者（p＜0.01）。COX回归分析表明,淋巴结转移以及Cyr61蛋白的表达水平是影响患者生存时间的独立危险因素,相对危险度分别是1.937（95%CI:1.144～3.281）和2.238（95%CI:1.080～4.634）。结论1食管癌组织Cyr61 mRNA和蛋白的表达水平显著高于其匹配的正常食管组织。Cyr61mRNA和蛋白的表达与肿瘤体积、分化程度、浸润深度以及淋巴结转移显著相关。Cyr61蛋白与吸烟和肿瘤家族史也是显著相关的。2 Cyr61蛋白高表达患者组和淋巴结转移患者组的平均生存时间分别显著低于Cyr61低表达患者组和淋巴结未转移患者组。Cyr61蛋白的表达水平和淋巴结转移是影响患者生存时间的独立危险因素。3 Cyr61的高表达可能与食管癌的发生、发展及转移有着密切的关系,并影响着患者的预后,因此Cyr61可作为食管癌患者术后预后的一个评价指标,并可能成为基因治疗的一个作用靶点。