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木质纤维素原料种类多、分布广、数量巨大,通过燃料乙醇生产技术、厌氧沼气发酵技术将其转化成乙醇、沼气等二次能源,一定程度上可以缓解化石能源的不断消耗所带来的能源危机,也解决了农林废弃物引起的环境污染问题。其中以木质纤维素原料生产燃料乙醇,还可以避免以淀粉类和糖类原料生产燃料乙醇时带来的“与人争粮”等一系列问题。因此具有重要的经济效益、环境效益和社会效益。
然而,木质纤维素原料结构致密,木质素包裹在纤维素、半纤维素外围,导致其很难被降解利用,必须进行适当的预处理,去除木质素,打破原有的致密结构,利于原料的后续利用。因此,预处理成为木质纤维素原料能源化利用的关键。而目前预处理环节的费用过于昂贵,于是寻找一种高效、低成本的预处理方法是当今研究的热点。
本论文采用组合白腐真菌对木质纤维素原料进行生物预处理研究,与其他物理化学法相比,该法有着专一性较强、反应温和、不造成环境污染、成本低等优势。白腐真菌主要通过分泌木质素降解酶对木质素进行降解,从而破坏原料的致密结构,提高后续利用效率。所以木质素降解酶酶活的高低是影响原料预处理效果的一个关键因素。于是本论文首先通过将白腐真菌进行组合的方式提高木质素降解酶(漆酶,Lac)酶活;接着对组合菌的菌株相互作用机理进行研究,阐明组合菌Lac酶活提高的原因,为菌株组合提高Lac酶活这种方法的应用提供理论依据,同时也为后续组合白腐真菌预处理木质纤维素原料提供指导;进一步采用固态发酵和木质素降解酶两种方式对木质纤维素原料进行预处理研究,最大化去除木质素成分,破坏原料的致密结构;最终对预处理后原料的酶解糖化进行初步研究,为原料后续的能源化应用奠定基础。具体研究结果如下:
(1)以实验室保存的三株主要分泌Lac的白腐真菌为出发菌株,筛选得到一组Lac酶活明显提高的组合菌55+m-6,其中菌株55为Trametes trogiisp.,m-6为Trametes versicolorsp.,组合后Lac酶活较单菌株分别提高24.13倍和4.07倍。组合菌的最适产酶条件为pH6.5、C/N16:1、Tween80添加量为0.01%,在该条件下组合菌的Lac酶活峰值比未优化时提高4.11倍。
(2)对组合菌55+m-6菌株间相互作用机理进行研究,发现菌株之间不存在抑制作用;平板培养时,菌丝交界处Lac酶活最高并分泌棕色色素;液体培养时,菌株m-6对组合后Lac酶活的提高起着更为重要的作用:菌株m-6的菌块、过滤灭菌胞外物以及高温灭菌胞外物均能明显刺激菌株55的Lac产生;菌株55、m-6进行组合后,同工酶种类未发生增减,但有三种Lac同工酶浓度有所提高;对菌株胞外物进行薄层层析和质谱分析,结果表明组合前后菌株胞外物中各物质在浓度上存在较大的变化。推测组合菌Lac酶活的明显提高,主要是由于菌株m-6胞外物中的一些物质能刺激菌株55分泌大量Lac进行代谢,且这些刺激物质并非菌株m-6特有,菌株55自身也可以代谢生成,但是适当的浓度才能刺激Lac的大量分泌。
(3)将组合菌55+m-6用于固态发酵预处理木质纤维素原料,发现其对玉米秆的降解程度最大,在粉碎度40目、含水率65%的最优处理条件下,处理至第15d,秸秆失重率为41.24%,其中木质素、纤维素、半纤维素均有降解,且Lac和纤维素酶(CMC)酶活以及还原糖量均达到峰值。
(4)对玉米秆进行木质素降解酶预处理,发现Lac/1-羟基苯并三唑(HBT)系统对玉米秆木质素的降解效果最好,在最优处理条件时,即HBT用量0.2%、处理时间1d、Lac用量50U/g,木质素降解率可达12.60%。预处理后玉米秆的致密结构被破坏,比表面积增大,利于后续酶与纤维素、半纤维素成分的结合。
(5)对预处理后的玉米秆进行酶解糖化,其中组合菌固态发酵预处理后玉米秆的糖化率比对照高4.33倍;Lac/HBT系统预处理后玉米秆的糖化率比对照高2.99%,糖化液中主要含有木糖、葡萄糖两种单糖。