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隐色素/光修复酶蛋白家族（cryptochrome/photolyase family,CPF）是一类修复遗传物质损伤以及调控生物体各种生化反应的蛋白。作为普遍存在于各类生物中的光受体蛋白,CPF蛋白借助黄素（Flavin Adenine Dinucleotide,FAD）等辅酶吸收光能来执行功能。CPF蛋白依据功能差异可分为光修复酶和隐色素两类蛋白。光修复酶主要是一类可以直接修复紫外线造成的DNA损伤的蛋白,它通过吸收315-500 nm波长范围的光,并以此为能量催化修复DNA上的紫外损伤,恢复DNA的正常结构。正常情况下,紫外线会造成两种主要的DNA损伤,即环丁烷嘧啶二聚体（CPD）和嘧啶-嘧啶酮（6-4）光产物,这两种二聚体都会抑制DNA复制和转录。根据修复的底物不同,光修复酶可以进一步分为CPD光修复酶和6-4光修复酶两大类。其中CPD光修复酶根据序列同源性,又分为CPD I/III型和CPD II型光修复酶。隐色素是与光修复酶序列同源、结构相似但缺乏光修复能力的蛋白。在拟南芥中首次发现隐色素后,如今在各种动植物体中都发现了隐色素。作为一类能介导各类反应的中间受体蛋白,隐色素参与生物体的生长发育、生物节律调节或导航作用。根据物种分布的差异,可以分为植物隐色素和动物隐色素。植物隐色素主要参与植物中各种蓝光反应,调节植物的生长发育。动物隐色素则是参与生物节律方面的调控,使生命活动呈现周期性。基于功能的差异,动物隐色素可进一步分为动物I型隐色素和动物II型隐色素。FAD作为电子传递的中间体,可以通过得失一个或是两个电子完成氧化还原反应。FAD存在5种基本形式:完全氧化型（fully oxidation,OX）;单电子还原态即自由基型（semiquinone,SQ）,可再分为蓝色中性自由基型（neutral blue semiquinone,NSQ）和红色阴离子自由基型（anionic red semiquinone,ASQ）;双电子还原态即完全还原型（hydroquinone,HQ）,可再分为中性还原型（neutral）和阴离子还原型（anionic）。本研究通过序列比对及结构分析,发现了一个关键氨基酸在不同的CPF蛋白中呈现出一定的分布特点,在大肠杆菌（Escherichia coli）中该位点为Ala377,所以以下统称为377位点。在CPD光修复酶中,377位点主要是丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺等空间位阻小或有极性的氨基酸;而在6-4光修复酶以及动物隐色素中,377位点则偏好于异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸等空间位阻大的疏水性氨基酸。由于该残基位于FAD的结合口袋,因此推测该位点对于FAD的氧化还原性质或稳定性有一定的作用,进而对CPF蛋白的功能产生影响。本研究通过定点突变分别构建了大肠杆菌CPD光修复酶、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）6-4光修复酶以及果蝇隐色素在377位点的突变体酶,对377位点的功能进行深入探究。SDS-PAGE结果显示,野生型E.coli CPD光修复酶全酶分子量为53 k Da,野生型P.tricornutum 6-4光修复酶全酶分子量为61 k Da,野生型果蝇隐色素全酶分子量为60 k Da。凝胶过滤层析结果与SDS-PAGE结果相一致,表明以上三种蛋白皆为单体结构。与野生型CPF蛋白相比,紫外-可见光光谱实验结果显示,377位点是丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺的突变体酶的FAD特征吸收峰都发生了蓝移现象,而377位点是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸的突变体酶的吸收峰则发生了红移现象。这是由于FAD结合口袋周围的结构发生了改变,引起FAD辅酶异咯嗪环上的π电子云离域发生了改变。在光照还原实验中,377位点是Ala、Ser、Asn的突变体酶比野生型光修复酶的还原速率更快,量子产率更高;而改造为Ile的突变体酶的还原速率明显减慢,量子产率较低;在果蝇隐色素中,377位点是Ser及Asn的突变体酶（V415S and V415N）可以进一步将FAD还原为完全还原型（HQ）。在氧化动力学实验中,377位点是Ala、Ser、Asn的突变体酶,相比于野生型光修复酶,其还原型FAD在空气中的氧化速率更慢;而带有Ile的突变体,则还原型FAD氧化更快。在活力持久性实验中,Ala、Ser、Asn未能直接提高蛋白的催化活性,但由于提高了蛋白的抗氧化能力,从而使得蛋白的活力保持更持久,这种现象在CPD光修复酶中尤为明显。本研究证明了377位点残基能够调节光修复酶HQ的稳定性,并且将377位点替换为Ala、Ser、Asn等CPD光修复酶偏好的氨基酸后,会提高HQ的稳定性,反之替换为空间位阻大的疏水性残基后会降低HQ的稳定性。类似地,动物隐色素377位点是空间位阻大的疏水性残基,可能可以通过保持ASQ或NSQ的状态来维持信号介导作用。野生型的果蝇隐色素只能被光还原为ASQ状态,但将果蝇隐色素第415位残基（377位点的同源位点）突变成Ser或Asn后,FAD辅酶能够进一步还原为HQ。因此,本研究揭示了在CPF蛋白家族里,与377位点同源的位点出现空间位阻大的疏水性氨基酸残基,可能是一个重要的进化事件,即可能是光修复酶向动物隐色素进化的有力支持证据。