论文部分内容阅读
8:2氟调醇(8:2 FTOH)具有良好的疏水性和疏油性,因此其作为一类表面材料被广泛应用于生活与生产中,并且在环境中也普遍存在。由于8:2 FTOH的产量与使用量逐年增加,其生物毒性受到了越来越多研究者的关注。目前研究表明8:2 FTOH具有肝脏毒性、肾脏毒性、生殖毒性和内分泌干扰效应等,但8:2FTOH的免疫毒性有待进一步探索。因此,为了填补8:2 FTOH的免疫毒性相关研究的空白,本课题分别以小鼠巨噬细胞系RAW 264.7、小鼠原代巨噬细胞以及C57BL/6小鼠为模型,从体外和体内综合探讨8:2 FTOH的免疫毒性。首先,将小鼠巨噬细胞系RAW 264.7和小鼠脾脏原代细胞分别作为小鼠固有免疫系统和适应性免疫系统的代表,体外探索8:2 FTOH对小鼠固有免疫系统和适应性免疫系统的影响。在小鼠巨噬细胞相关实验中,引入活性羰基(RCS)清除剂—盐酸肼屈嗪(Hyd),并从细胞活力和免疫功能两大方面入手,以探究8:2 FTOH对小鼠巨噬细胞的免疫毒性及其可能机理。细胞活力方面涉及MTT细胞活力检测、Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡、EdU法检测细胞增殖能力、PI法检测细胞周期分布、DCFH-DA法检测胞内活性氧(ROS)水平以及RT-qPCR法检测细胞增殖相关基因表达;免疫功能方面涉及RT-qPCR法检测促炎因子和抗原呈递相关基因的表达水平以及ELISA法检测细胞上清液中促炎因子含量,另外还使用了FITC标记的大肠杆菌颗粒来检测巨噬细胞的吞噬能力。结果表明,8:2 FTOH暴露能够造成RAW 264.7细胞活力下降、细胞周期G1期和G2/M期阻滞、细胞增殖能力减弱、促炎因子和细胞增殖相关基因表达量下降以及抗原呈递相关基因表达紊乱。虽然在本实验设定的8:2 FTOH浓度(10~100μM)下,并未观察到RAW 264.7细胞的凋亡,也未见胞内ROS水平以及吞噬能力的显著变化,但是Hyd能够部分缓解8:2 FTOH造成的细胞毒性。这些结果说明8:2 FTOH能够通过抑制小鼠巨噬细胞中细胞周期相关基因来诱导细胞周期延滞,最终导致小鼠巨噬细胞活力下降;Hyd能够消除8:2 FTOH引起的细胞周期延滞,并恢复RAW 264.7的增殖能力,从而在一定程度上缓解8:2 FTOH的细胞毒性;8:2 FTOH能够通过抑制促炎因子表达和干扰抗原呈递相关基因表达来干扰巨噬细胞的免疫功能。在小鼠原代脾脏细胞相关实验中,在分别用刀豆蛋白A(Con A)或脂多糖(LPS)共暴露后,MTT法检测8:2 FTOH对原代脾脏细胞活力的影响;Con A共处理条件下,ELISA法检测原代脾脏细胞的上清液中干扰素-γ的含量。结果表明,8:2 FTOH暴露后小鼠原代脾脏细胞的细胞活力以及细胞上清液中干扰素-γ含量均出现显著下降。这部分结果说明8:2 FTOH造成了小鼠原代脾细胞的免疫功能损伤。其次,将6周龄雄性C57BL/6小鼠作为体内实验模型,8:2 FTOH浓度设置为0、1、10和100 mg/kg/day,连续灌胃暴露28天,以探讨8:2 FTOH对小鼠的免疫毒性。实验期间,每隔一周记录一次体重和食物消耗量。暴露结束后,取小鼠血清,采用ELISA法检测促炎因子含量,并使用相应试剂盒检测谷胱甘肽(GSH)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力;取小鼠胸腺、肝脏以及脾脏,记录鲜重,并制成H&E染色切片,从组织病理学角度评价组织损伤程度。另外,本实验还用RT-qPCR法检测了各组织中促炎基因表达量变化,并同样用相应试剂盒检测肝脏中GSH含量以及SOD和CAT活力。结果表明,亚慢性暴露8:2 FTOH造成小鼠血清中IL-1β和GSH含量以及SOD和CAT活力下降、肝脏肥大以及组织形态改变,但脾脏与胸腺中并未发现明显损伤。亚慢性暴露8:2 FTOH还造成了组织中促炎因子基因表达紊乱和肝脏组织中GSH含量以及SOD和CAT活力下降。另外,未发现8:2 FTOH暴露对体重、食物消耗量和脾脏及胸腺组织形态结构产生显著影响。这些结果说明8:2 FTOH能够造成小鼠免疫系统损伤以及肝脏与血清中抗氧化能力减弱。综上所述,本课题研究发现8:2 FTOH对小鼠免疫系统存在潜在危害,为氟调醇类工业原料的免疫毒性及其机制相关研究提供参考,并为规范使用氟调醇类提供了一定的理论依据。