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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由黄病毒科瘟病毒属中的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高致病性传染病。该病对许多国家的养猪业、生猪生产以及猪产品加工业造成危害。本研究利用大肠杆菌表达系统表达CSFV的E2截段蛋白,并以胶体金颗粒标记和量子点耦联重组蛋白,建立可检测CSFV抗体免疫层析试纸条的方法。1.CSFV E2基因的原核表达本研究选用E2蛋白上一段具有抗原表位区的序列,构建pET-32a-E2重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行重组蛋白可溶性鉴定、诱导条件优化、重组蛋白纯化及抗原性鉴定。结果显示,成功构建重组质粒pET-32a-E2,经诱导获得重组蛋白,以包涵体的形式存在;经纯化重组蛋白的表达量为0.8 mg/mL;Western Blotting结果表明重组蛋白具有抗原性;此外重组蛋白混合佐剂,免疫新西兰白兔,成功制备兔抗重组蛋白多克隆抗体。2.胶体金免疫层析检测猪瘟病毒抗体方法的建立制备胶体金溶液并以其标记重组蛋白,优化标记条件;检测线(T线)包被兔抗猪IgG,质控线(C线)包被兔抗重组E2蛋白多克隆抗体,并对兔抗猪IgG浓度优化和兔抗重组E2蛋白多抗稀释倍数进行优化,制备免疫层析试纸条,对试纸条性能进行检测。结果表明试纸条具有良好的特异性和重复性,并且稀释CSFV阳性血清到1:25时仍得到阳性结果,证明其灵敏性较好;此外,应用于临床样品检测时,本方法与CSFV抗体检测ELISA试剂盒(IDEXX)阳性结果符合率:92.1%。3.量子点免疫层析试纸条检测猪瘟病毒抗体方法的建立量子点耦联重组蛋白,优化耦联pH、活化剂、标记量等条件,T线包被兔抗猪IgG,C线包被兔抗重组蛋白多克隆抗体,并对兔抗猪IgG浓度优化和兔抗重组蛋白多抗稀释倍数进行优化;制备免疫层析试纸条,并对试纸条的性能检测。结果表明试纸条具有良好的特异性和重复性,并且稀释CSFV阳性血清到1:30时仍得到阳性结果,证明其灵敏性好且优于胶体金试纸条;此外,应用临床样品检测时,本方法与CSFV抗体检测ELISA试剂盒(IDEXX)阳性结果的符合率为95%。